罗氏沼虾Dmc1基因的克隆及表达分析

DNA减数分裂重组酶1基因(disrupted meiotic cDNA 1,Dmc1)是在减数分裂过程中特异表达的基因。为了研究罗氏沼虾卵巢发育的分子机制,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得罗氏沼虾Dmc1基因的全长cDNA序列(MrDmc1),并对MrDmc1基因编码的蛋白进行理化性质、亲疏水性、亚细胞定位以及蛋白质结构等生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术检测Dmc1基因在卵巢、肌肉等组织中的表达量。结果显示,MrDmc1基因的ORF全长1 026 bp,共编码341个氨基酸;MrDMC1蛋白分子量为37.4 ku,该蛋白没有跨膜区域和信号肽切割位点,含有1个N-糖基化位点和25个磷酸化位点,是亲水性蛋白,主要存在于细胞质中。系统进化树发现,罗氏沼虾MrDmc1基因与克氏原螯虾、凡纳滨对虾等甲壳类动物进化关系较近。荧光定量PCR结果显示,MrDmc1基因在7种组织中均有表达,在心脏中表达量最高,在眼中表达量最低;MrDmc1基因的表达量在卵巢发育过程中呈先升高后降低的趋势,在卵巢发育Ⅱ期的表达量最高。研究表明,MrDmc1基因参与了罗氏沼虾卵巢发育的调控,推测...     

SNP标记位点与罗氏沼虾生长性状的相关分析

【目的】明确SNP标记位点与罗氏沼虾生长性状间的关联性,为罗氏沼虾生长性状候选基因的寻找、生长性状调控机理及后期分子标记辅助育种研究打下基础。【方法】采用直接测序技术对25个SNP标记位点在罗氏沼虾生长性状极端群体中进行多态性检测。采用卡方检验（χ2）筛选出2个极端（体长极大和极小）罗氏沼虾群体中与生长状况存在潜在相关性的SNP标记位点,进一步对罗氏沼虾浙江群体60个个体进行SNP基因型与生长性状（体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重）的关联分析。运用一般线性模型对SNP标记位点与罗氏沼虾5个生长性状的关联性进行检测。【结果】卡方检验结果显示,SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24等5个标记位点在罗氏沼虾极端群体中与生长性状存在潜在相关。5个潜在相关SNP标记位点与生长性状的相关性分析结果表明,SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4个位点与生长性状呈显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01,下同）相关,其中位点SNP6与体长和体重关联极显著,与头胸甲宽关联显著;SNP7与体长、头胸甲宽、第一腹节宽和体重关联极显著,与第一腹节高关联显著;SNP16与头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重关联极显著,与体长关联显著;SNP24仅与第一腹节高关联显著。对浙江群体中60尾个体体长50%小个体和体长50%大个体2个群体中4个SNP位点的基因型频率进行统计,结果显示,SNP6和SNP24 2个标记与生长的关联性显著,SNP7和SNP16与生长的关联性极显著。【结论】HSP90和HGS基因可能是与罗氏沼虾生长相关的重要功能基因,研究结果为下一步基因定位及分子标记辅助育种提供了更多的标记基础。     

罗氏沼虾投饵技术研究

通过设计制作投饵装置,开展罗氏沼虾池塘养殖试验,基于试验结果综合分析,得出其分布与摄食习性,以及体重、体长随摄食量的增长而呈现生长变化特征,在8月中旬之前,罗氏沼虾的体长、体重、摄食量随养殖时间增长趋势较为平缓,而8月中旬至8月底,趋势迅速;体长与摄食量成正相关,体长随摄食量的增长方程为y=8E-10x4-6E-07x3+0.0001x2+0.0133x,体重与摄食量呈现正相关的关系,体重随摄食量的增长方程为y=2E-09x4-2E-06x3+0.0004x2-0.0192x。建议根据罗氏沼虾的生长阶段及水温等主要环境因子变化调控投饵量与频次。     

罗氏沼虾形态性状对体重的影响

随机选取391尾5月龄罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii),测定体重、体长、全长、头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高、尾节长、额剑上齿数、额剑下齿数以及第1腹节至第6腹节的长、宽、高共27个性状指标.采用简单相关分析和偏相关分析,计算各性状指标间的简单相关系数和偏相关系数,并进行各性状对体重的多元回归分析,剔除偏回归系数不显著(P＜0.05)的性状,建立了以罗氏沼虾体长、全长、头胸甲长、头胸甲高、第1腹节宽、第1腹节高、第2腹节宽、第6腹节宽对体重的多元回归方程.在此基础上进行了主成分回归分析和岭回归分析,并建立了其对体重的回归方程.最后计算其对体重的通径系数、决定系数.结果表明:除额剑上齿数和额剑下齿数外,罗氏沼虾其他形态性状对体重的简单相关系数都达到极显著水平(P＜0.01),只有体长、头胸甲高、第1腹节宽、第1腹节高和第6腹节宽对体重的偏相关系数达到显著水平(P＜0.05)或极显著水平(P＜0.01).通径系数大小顺序与决定系数一致,最大值分别为0.387和0.150.本研究为罗氏沼虾选择育种提供了测度指标.     

不同启动子eGFP载体在罗氏沼虾活体内的表达效率比较

为筛选出较强的启动子用于提高外源基因在罗氏沼虾活体细胞中的转化表达效率,本研究构建包含eGFP基因和IE1、hr5-IE1及Sv40启动子的3个表达载体,分别按照10 μg·g^-1标准注射于体重5~7 g的活体罗氏沼虾肌肉内,采集注射活体肌肉的RNA样品检测各个启动子转录eGFP基因的效率。结果表明,在罗氏沼虾体内hr5-IE1启动子对eGFP基因的表达活性最强,其对eGFP外源基因的转录水平是IE1的3倍以上,IE1对于eGFP的转录水平也显著高于SV40的转录启动效率,其中SV40在罗氏沼虾体内的转录启动水平未检测到eGFP基因的转录表达,表明包含节肢动物门跨物种转录调控元件(增强子hr5)的IE1启动子能够在罗氏沼虾体内正常启动下游基因的转录表达及翻译,是罗氏沼虾开展分子功能研究较优的外源基因表达启动调控元件。     

罗氏沼虾高产养殖技术

介绍了罗氏沼虾高产养殖技术,包括清塘消毒、移植水草、虾苗投放、饵料投喂、水质管理、日常管理、捕捞等方面内容,以供养殖户参考。     

罗氏沼虾幼体培育试验

[目的]研究罗氏沼虾幼体培育技术。[方法]在127.3 m3水体中投放2 700×104 ind罗氏沼虾幼体,采取控制鱼苗密度、加强水质调控、不用抗生素的群落生态法进行培育,并观察培育效果。[结果]经25 d左右培育,90%幼体变态,获淡化虾苗1 721.3×104 ind,单位水体产量为13.5×104 ind/m3。平均育苗成活率为63.7%,平均运输成活率为85.9%。苗种达到DB45/T515-2008要求。[结论]生态法可对罗氏沼虾实现健康育苗。罗氏沼虾生态方法育苗切实可行。     

罗氏沼虾稻田养殖技术

从稻田的选择、田间工程建设、稚虾培育、虾种放养、铒科投喂、水质管理、日常管理、病虫害防治和收获等方面介绍了稻田罗氏沼虾的养殖技术．以期为罗氏沼虾的稻田养殖提供参考。     

罗氏沼虾白尾病研究进展

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是重要的淡水养殖虾类,其养殖主要集中在亚洲国家,仅中国罗氏沼虾的养殖年产量就占全球总产量的50%以上。虽然罗氏沼虾具有相对较强的抗病能力,但近年由于养殖密度过大、水环境恶化等原因,导致罗氏沼虾养殖过程病害问题时有发生,其中白尾病对罗氏沼虾幼苗期造成的危害较大。综述了罗氏沼虾白尾病的病原及传播、检测技术和免疫预防等方面的研究进展。     

罗氏沼虾生长性状的种内杂交优势及遗传力与遗传相关分析

为加快罗氏沼虾生长速度,以5个罗氏沼虾专门化品系选择系(A、B、C、D、E系)子四代为亲本,运用完全双列杂交方法建立了25个交配组合,90 d后对这些交配组合的子一代生长性状(体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高、体质量)进行种内杂交优势及遗传力与遗传相关分析。结果表明,除D×C组合外,其他杂交组合生长性状表型值均优于自交组合;所有杂交子一代均表现出平均杂种优势与超亲杂种优势,其中A×E组合杂交优势最大,可使体长增加17.22%,体质量增加71.08%;体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高及体质量的遗传力估计值依次为0.549、0.548、0.527、0.516和0.580,均达到了高度遗传力的标准;体长与体质量的遗传相关与表型相关均最大,分别为0.752 2和0.980 0;头胸甲宽与第一腹节高的遗传相关最小为0.667 5,体长与第一腹节高的表型相关最小为0.924 0。本研究可对罗氏沼虾进一步提高生长速度的杂交选育工作提供科学依据。     

罗氏沼虾野田村病毒和双顺反子病毒双重RT-PCR检测方法与序列分析

罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV）和双顺反子病毒（M. rosenbergii dicistrovirus, MrDV）是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60 ℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1 μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对病样总RNA的最低检测限为360 fg。引物的特异性检测表明,该检测方法对TSV、WSSV、IHHNV和嗜水气单胞菌TPS 30基因组无交叉反应。对阳性样品的病毒扩增序列分析表明,MrDV RNA依赖性RNA聚合酶编码区序列无变异,MrNV RNA2序列存在较多变异,进化树结果表明2011年长三角的MrNV病毒主要来自于中国基因型和东南亚基因型。该方法的建立为罗氏沼虾病毒性疾病的预防和种苗的繁育奠定了基础。     

罗氏沼虾同工酶表达组织差异性及遗传多样性分析

【目的】从生化遗传角度分析罗氏沼虾群体的同工酶基因座及其酶谱表型,明确不同群体的遗传多样性,为其种质资源鉴定及遗传育种研究等提供基础数据。【方法】采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对罗氏沼虾肌肉、复眼、鳃、心脏和肝胰腺等5种组织中的苹果酸脱氢酶（MDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、山梨醇脱氢酶（SDH）、苹果酸酶（ME）、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、乙醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、天冬氨酸脱氢酶（AAT）和酯酶（EST）等11种同工酶进行电泳分析,并选取肌肉同工酶对申漕群体、野生群体、抗病群体、生长群体和浙江群体（2017年引进种虾）等5个罗氏沼虾群体进行遗传学研究。【结果】同种同工酶在罗氏沼虾不同组织间所表现出的酶谱总数和酶带颜色（酶活性）存在明显差异,即罗氏沼虾同工酶具有明显的组织差异性;11种同工酶在罗氏沼虾5种组织中存在26个基因座。其中,EST在肌肉中未表达,但在肝胰腺中表达较多;ME在肌肉、复眼、鳃、心脏和肝胰腺等5种组织中均有表达;SOD-2只在肝胰腺中表达;PGM在肝胰腺和心脏中表达较多。罗氏沼虾肌肉中的7种同工酶存在11个基因座,有3个基因座（SDH-1、PGM-3和LDH-1）呈多态性,多态位点比例为27.27%。5个罗氏沼虾群体的平均预期杂合度在0.1006~0.1416,平均观测杂合度在0.1143~0.1762,Hardy-Weinberg遗传偏离指数（0.1362~0.2444）均为正值,即偏离Hardy-Weinberg平衡。【结论】罗氏沼虾同工酶具有明显的组织差异性,表现为不同组织间的酶谱总数和酶带颜色（酶活性）存在明显差异,因此同工酶可作为研究罗氏沼虾遗传多样性的一种生化遗传标志。5个罗氏沼虾群体均处于杂合子过剩状态,其遗传变异水平较高。     

罗氏沼虾Doublesex基因的cDNA克隆及性别二态性表达分析

克隆了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)含DM结构域的Dsx基因(MroDsx)部分序列,DM结构域包含5个保守的半胱氨酸(Cysteine)和2个组氨酸(Histidine), 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)结果显示:MroDsx基因仅在性腺中特异性表达,且在精巢中的表达量显著高于卵巢;在精巢发育早期(主要是精原细胞)高表达,随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(In situ hybridization,ISH)结果进一步显示:MroDsx转录本在精原细胞表达量高,在精母细胞以及精细胞中较弱,在成熟的精子中不表达,与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析,推测MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。     

干扰COX2基因对罗氏沼虾生长及能量代谢酶活性和基因表达的影响

【目的】从能量代谢的角度探索罗氏沼虾生长缓慢的原因,为分析和解决罗氏沼虾生长缓慢问题提供参考。【方法】利用合适浓度的siRNA抑制罗氏沼虾肝胰腺和肌肉中COX2基因的表达,分析肝胰腺和肌肉中线粒体呼吸链相关基因表达量和酶活性以及ATP含量的变化;通过持续抑制罗氏沼虾COX2基因的表达,分析其对罗氏沼虾生长的影响。【结果】siRNA对罗氏沼虾线粒体编码的COX2基因表达有抑制作用,在一定浓度范围内,随着siRNA浓度的增加抑制的作用越明显,超过一定的浓度范围的siRNA抑制作用不明显,浓度为2.0μg/g的siRNA与0.8、1.5、3.0μg/g的siRNA的抑制作用相比效果最好。罗氏沼虾注射siRNA后,肝胰腺和肌肉中的COX2基因表达量下调,ND1和ATP6基因表达量随之下调,COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性显著下降（P<0.05,下同）,ATP含量降低。连续注射siRNA能持续抑制罗氏沼虾肝胰腺和肌肉中COX2基因的表达,随着siRNA注射次数的增加,抑制COX2基因表达的作用时间也增加,在注射4次2.0μg/g siRNA虾的肝胰腺和肌肉中,COX2、ND1和ATP6的基因表达量持续下调的时间最长,COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性能长期保持在显著低于对照组的水平,ATP含量也显著低于对照组。随着肝胰腺和肌肉中COX2基因表达被抑制时间的增加,罗氏沼虾的体长与体重增加量越小,养殖28d后,注射1次siRNA和注射4次siRNA的虾的体重净增长分别为0.59和0.34g。【结论】当参与ATP合成的酶的基因表达量和酶活性长时间受到抑制时,会抑制罗氏沼虾的生长。     

RNA干扰不同类型TLR基因对罗氏沼虾免疫相关基因表达的影响

本研究探讨了罗氏沼虾三种Toll样受体基因（Toll-like receptors,TLRs）的生理功能,为罗氏沼虾的免疫研究提供基础。实验通过对罗氏沼虾注射0.4μg/g、0.8μg/g和1.2μg/g（siRNA/体质量）三种剂量小干扰RNA（Short-interfering RNAs,siRNA）将MrTLR1、MrTLR2和MrTLR3三种TLR基因分别沉默。并采用荧光定量PCR技术对这三种Toll样受体基因在注射siRNA后0h、6h、12h、24h和48h鳃组织中的相对表达量进行分析,结果显示1.2μg/g组为最适干扰剂量。选取注射1.2μg/g siRNA后0h、24h以及48h鳃样品,结果显示在沉默MrTLR1后,罗氏沼虾体内髓样分化因子88基因（MyD88）、甲壳素基因（Crustin）和抗脂多糖因子基因（ALF）的相对表达量均出现显著下降,相反MrTLR2的相对表达量出现了上升;将MrTLR2沉默之后,MyD88以及Crustin的相对表达量明显下降;而在沉默MrTLR3后,免疫缺陷同系物基因（IMD）以及ALF的表达量显著上升,此外三种TLR基因的沉默对酚氧化酶原基因（proPO）的表达没有影响。研究结果表明MrTLR1和MrTLR2可调控MyD88以及抗菌肽的表达;而MrTLR3不仅参与Toll信号通路,也可能影响IMD信号通路。     

罗氏沼虾5个专门化品系选择系繁殖力的比较分析

为探讨罗氏沼虾繁殖性能,本实验通过测定5个罗氏沼虾专门化品系选择系(A、B、C、D、E系)连续3次抱卵的单位体质量抱卵量(F_W)、卵巢发育周期(C_O)、受精卵卵径(D_E)、卵黄蛋白原(VTG)含量、组织蛋白酶D(CTSD)活性等指标,比较分析5个选择系的繁殖力,以期筛选出高繁殖力品系罗氏沼虾。结果显示:罗氏沼虾绝对抱卵量(F)、F_W与体质量正相关显著(P0.05),F与F_W呈极显著正相关(P0.01);5个选择系的三次抱卵F_W平均值范围为(1.96～2.30)×10~3粒/g,各系间差异显著(P0.05),其中B和D的F_W较高,分别为2.26×10~3粒/g和2.30×10~3粒/g;5个选择系受精卵中VTG含量、CTSD活性的平均值范围分别为3.48～5.80μg/g、271.81～320.82 U/g,各系间差异均显著(P0.05),其中受精卵VTG含量最高为B的5.80μg/g,CTSD活性最高为D的320.82 U/g,次之为B的303.09 U/g,两者无差异(P0.05);C_O范围为18.8～23.8 d,第二次大于第一次(2～8 d),各系间无差异(P0.05),但均显著小于对照组(P0.05);D_E平均值范围为542.3～552.0 nm,各系间无差异,B、D选择系D_E均值较大,分别为551.7 nm、552.0 nm。因此可认为罗氏沼虾5个专门化品系选择系中B和D的繁殖力最强,A选择系次之,C和E选择系最弱,此可为罗氏沼虾专门化品系选择系的选育提供依据。     

罗氏沼虾养殖塘草甘膦残留特征及生态风险评估

为了解罗氏沼虾养殖环境中草甘膦除草剂的残留特征及其生态风险,于2019年5月至10月,对上海市金山区三口罗氏沼虾养殖塘养殖水、沉积物及塘埂土样品中草甘膦的浓度进行监测,并采用商值法对养殖水和沉积物中草甘膦的生态风险进行评估。结果显示：养殖周期内,养殖塘水中草甘膦的检出率为46.7%,最大残留值为57 μg/L;虾塘沉积物及塘埂土中草甘膦的检出率分别为83.3%和77.8%,最大残留值分别为1149 μg/kg和5057 μg/kg。生态风险评估结果显示,养殖周期内养殖水中残留草甘膦对所选敏感生物的生态风险等级主要为无明显风险和中等风险,沉积物中残留草甘膦对所选敏感生物的生态风险等级主要为中等风险和低风险。研究表明,金山区罗氏沼虾养殖环境中草甘膦的残留水平与国内外其他地区相比处于中等水平,主要来源为塘埂除草时草甘膦除草剂的使用,养殖塘水及沉积物中残留草甘膦对罗氏沼虾养殖存在潜在风险。     

沉水植物对罗氏沼虾养殖系统的水质调控效应

为研究沉水植物对罗氏沼虾养殖系统的水质调控效应,比较了生态养殖组与传统养殖组的水质、浮游动植物和微生物群落结构特征,解析了浮游动植物、微生物优势种群与水环境因子之间的关系。结果表明:两组养殖水体水质与浮游生物群落结构均存在显著差异。生态养殖组的总磷(TP)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)和叶绿素a(Chl-a)浓度均低于传统养殖组。传统养殖组浮游植物与浮游动物生物量均高于生态养殖组,两组浮游植物与浮游动物多样性指数存在显著差异。微生物主要包括放线菌门、拟杆菌门、蓝细菌门和变形菌门,其中生态养殖组放线菌门的丰度最高,传统养殖组优势菌为蓝细菌门的微囊藻属、鱼腥藻属以及拟杆菌门的黄杆菌属。冗余分析结果表明TP、COD和溶解氧(DO)是影响水体浮游生物群落组成与分布的关键因子。综上所述,利用沉水植物开展罗氏沼虾养殖水环境的原位净化,可显著消减养殖水体氮、磷营养盐,降低浮游动植物生物量,提高水体微生物群落结构稳定性,改善养殖水环境。     

黑羽番鸭LPL基因克隆及在肌肉发育中的表达规律

脂蛋白脂酶(LPL)是水解甘油三酯的关键性酶,可以为细胞提供游离的甘油三酯,并作用于脂蛋白循环,与机体的脂质代谢有密切关系。本研究利用同源克隆策略克隆黑羽番鸭LPL基因,并采用实时荧光定量PCR技术分析其在肌肉组织发育过程中mRNA表达规律。结果表明,黑羽番鸭LPL基因cDNA序列长度为1515 bp,包括了1485 bp的编码区,编码494个氨基酸。与禽类LPL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在90%以上,与人和哺乳动物同源性在70%~75%之间。实时荧光定量PCR检测结果显示,LPL基因在第2周龄胸肌中mRNA表达量较低,然后开始上升,达到最大值再出现下降并保持在一定水平上;公鸭腿肌表达规律和公鸭一致,但是母鸭腿肌表达量呈波浪状。     

罗氏沼虾养殖周期中PAHs的生物累积特征及食用风险评价

多环芳烃(PAHs)是一种由2个或者多个苯环组成的具有致癌性的有机污染物,广泛地存在于各种环境介质中。为了解上海金山区漕泾建国路某养殖虾塘内罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)体内多环芳烃的残留水平及食用风险,测定了采自2018年7—9月金山区罗氏沼虾体内16种PAHs的浓度,分析不同时期的累积特征并计算了其潜在食用风险。研究结果表明:除了ANY、ANA、DBA、IPY和BPF以外,其余的11种PAHs均有不同程度的检出,不同时期罗氏沼虾体内∑PAHs浓度范围为47.6～106 ng/g干重。PAHs优势组分为3,4环结构,其中4环占比最高,优势单体为ANT、BaA和CHR;溯源分析结果表明,研究池塘内PAHs主要是来源于燃烧源。采用美国环保署(USEPA)推荐的健康风险模型对食用罗氏沼虾引起的健康风险评价结果表明,金山区罗氏沼虾养殖虾塘PAHs致癌风险R_(ILC)值处于可接受水平,不会对消费者的人体健康产生影响。