草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

团头鲂铁蛋白基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染下的表达

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆团头鲂Megalobrama amblycephala铁蛋白基因c DNA全长序列;同时研究经嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒后团头鲂肝组织中铁蛋白表达的变化,了解铁蛋白基因在团头鲂免疫应答中的作用。结果表明:团头鲂铁蛋白c DNA全长序列包括150bp的5’末端序列(untranslated region,UTR),270bp的3’UTR,以及522bp编码174个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)。这些氨基酸序列同其他鱼类铁蛋白M链氨基酸序列同源性较高。团头鲂铁蛋白基因在5’非编码区核甘酸序列124~154的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。荧光定量PCR分析表明:铁蛋白基因在团头鲂肌肉、心脏、鳃、肝胰脏、脑和肾脏等组织器官中都有表达,在肝胰脏的表达量最高,脑组织表达量最低。经嗜水气单胞菌急性感染后,团头鲂肝胰脏组织中铁蛋白基因表达量显著上调。上述结果表明:团头鲂铁蛋白M亚基在团头鲂免疫应答过程中起重要作用。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR）,189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF）,编码354个氨基酸,预测其蛋白质分子量约40．10kDa,等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征,包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示,MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达,但表达量各有不同,其中较强的表达于头肾;中等程度表达于鳃、脾和肠;在心、脑和肌肉中表达较弱。     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

鲮β-肌动蛋白基因的分子克隆及其作为分子内标的可靠性分析

β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。     

日本鳗鲡脂肪酸去饱和酶和延长酶基因的克隆与分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆得到日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中控制高不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acids,HUFA）合成的脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase,FAD）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase,ELO）全长cDNA序列。结果表明,2456bp的FAD全长cDNA序列含长达1046bp的3’-UTR、75bp的5’-UTR和编码444个氨基酸的长1335bp的阅读框。编码的蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素h5结构域,与其他具有不同生活史鱼类的FAD氨基酸序列具有70．5％～77．5％的同源性;分析显示其在系统树中与溯河洄游鱼类的亲缘关系最近。克隆得到的ELO全长cDNA序列长1239bp,含有885bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其他鱼类ELO氨基酸具有87．1％～88．8％的同源性;其在系统树中与北非鲶鱼（Clarias gariepinus）和斑马鱼亲缘关系较近。日本鳗鲡FAD和ELOcDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

团头鲂促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体中促甲状腺激素β亚基（TSHβ）基因，并对其基因结构和系统进化进行分析。该基因cDNA序列全长614bp；5’端非翻译区100bp；3’端非翻译区61bp；开放阅读框架（ORF）453bp，共编码150个氨基酸。其编码的氨基酸序列与鳙鱼（Aristichthys nobili5）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、金鱼（Carassius auratus）、斑马鱼（Daniorerio）、鲑鱼（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mysiss）、欧洲鳗鲡（A．nnguilla）的相似性分别为：99．3％、92％、92％、82％、62．6％、62．6％和56％。核苷酸序列分析显示，团头鲂与鳙鱼相似性最高，为98．23％；与欧洲鳗鲡相似性最低，为48．7％。说明唧亚基在长期的进化中相当保守。在所比较的9种鱼类该基因ORF氨基酸序列中都含有定位相同的12个半胱氨酸残基，它们在成熟肽中形成6个二硫键，这对保证促甲状腺激素的空间结构，维持促甲状腺激素的生理功能起着重要的作用。该基因的成功克隆不仅为TSHβ的分子进化和相似性比较研究提供了新的资料，而且对进一步研究该基因的功能、表达具有重要的意义。     

西伯利亚鲟CXCR7基因cDNA全长的克隆及其表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),首次克隆了西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的CXCR7a和CXCR7b基因的全长cDNA。CXCR7a的cDNA全长为2 325 bp(登录号为:JQ034508),包括207 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码362个氨基酸的1 086 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 032 bp的3'端非翻译区(UTR);CXCR7b的cDNA全长为2 423 bp(登录号为:JQ034509),包括209 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码370个氨基酸的1 110 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 104 bp的3'端非翻译区(UTR),并对它们编码的蛋白质序列的分子特征进行了分析。氨基酸序列相似性(similarity)分析表明,CXCR7a与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)的CXCR7相似性分别为82.6%、81.4%、80.9%、81.0%;CXCR7b与人、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼的CXCR7相似性分别为82.9%、82.3%、80.8%、82.5%;西伯利亚鲟CXCR7a与其CXCR7b的相似性最高为96.5%。系统进化树分析显示,西伯利亚鲟与斑马鱼聚为一簇,两栖类聚为一簇,其它高等脊椎动物再进行聚类。对CXCR7a和CXCR7b在各发育时期胚胎及仔鱼的表达状况分别进行定性分析表明,CXCR7a在除卵裂期、囊胚期的胚胎外,其在原肠胚中期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达,CXCR7b在卵裂期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达。另外,从基因组DNA水平上表明CXCR7a和CXCR7b来自不同的基因拷贝。这些结果为进一步研究CXCR7在西伯利亚鲟侧线系统发育中的作用提供了新的基础资料。     

厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)神经肽Y cDNA克隆和序列分析

利用RT-PCR的方法获得了厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)NPY基因的编码序列。结果显示:厚颌鲂NPY基因长度为302 bp,包含了NPY基因291 bp的整个开放阅读框,共编码96个氨基酸,其分子量预测值为10987.4,理论等电点为5.72。通过ClustalX软件,将厚颌鲂与21个物种NPY的氨基酸序列进行比对,再结合Blastp分析的结果发现,厚颌鲂NPY氨基酸序列与鲤、中华倒刺鲃、鲫、斑马鱼、岩原鲤等鲤科鱼类的同源性最高,其同源性分别为100%、97%、95%、93%、93%。根据包括厚颌鲂在内的22个物种的NPY氨基酸序列的同源性构建进化树,其同源性与各鱼种分类地位一致。     

鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinch...     

鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）和鳐（Leucoraja erinacea）的同源性最低为74.5%,与三种鸟类的同源性为75%左右。这结果也说明,Hox同源框基因序列在进化上高度保守。在序列比较的同时发现了2个鲤的SNP位点,T101C和A213G。上述研究结果,对于保护生物多样性（尤其是遗传多样性）的研究,揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义。     

黄颡鱼cGnRH基因的筛选鉴定及生物信息学分析

本研究在前期已获得的黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco转录组基础上,利用BLAST程序从中筛选获得黄颡鱼c Gn RH基因的候选序列,再通过氨基酸序列分析从中筛选获得c Gn RH的全长c DNA为261bp,编码86个氨基酸,其核心十肽的序列为QHWSHGWYPG,相对分子质量为9 755.5、理论PI值为9.02。序列同源比对发现:黄颡鱼与斑马鱼Danio rerio、草鱼Ctenopharyngodon idella、鲤Cyprinus carpio中c Gn RH氨基酸的相似性分别高达70.93%、68.60%和67.44%。用MEGA构建的黄颡鱼与其他27种硬骨鱼c Gn RH的Neighbour-joining进化树发现,黄颡鱼c Gn RH先与脂鲤科的墨西哥丽脂鲤Astyanax mexican共聚类,再依次与鲤科的斑马鱼、草鱼、黑头呆鱼Pimephales promelas、稀有鮈鲫Gobiocypris rarus等鱼的c Gn RH序列聚类。本研究首次筛选获得黄颡鱼的c Gn RH序列,并利用生物信息学软件进行鉴定分析,为后续的基因表达和c Gn RH调节生长生殖作用的研究提供序列资源及基础。     

鲤（Cyprinus carpio）Rh糖蛋白家族基因的克隆与组织mRNA表达

为了研究鱼类氨代谢机制,克隆了鲤（Cyprinus carpio）Rh糖蛋白家族的Rhag、Rhbg、Rhcgl基因的cDNA全序列,与人类Rh基因的氨基酸序列比对结果显示,鲤Rh糖蛋白保守性较高。系统分析表明,鲤3个Rh基因与斑马（Daniorerio）Rh基因的亲缘关系较近。Rhag、Rhbg、Rhcgl基因在鲤鳃组织中表达较高,而在其它组织表达的相对量极低。比较3个基因在鳃组织的表达,Rhbg的表达量极显著高于其它2个基因。这一结果预示Rhag、Rhbg、Rhcgl与鲤的氨代谢密切相关,尤其是Rhbg基因,可能是鲤氨代谢的重要因子。     

Partial characterization of the gene encoding myoadenylate deaminase from the teleost fish <Emphasis Type="Italic">Platichthys flesus</Emphasis>

AMP-deaminase (AMPD, EC 3.5.4.6), which catalyzes the irreversible hydrolytic deamination of AMP to IMP and ammonia, is an important energy-related enzyme. The partial genomic sequence of the gene encoding myoadenylate deaminase (AMPD1) from the teleost fish Platichthys flesus was determined. The amino acid sequence of P. flesus AMPD1 shows 82% homology with that of the teleost fish Danio rerio. Comparison of genomic sequences of P. flesus and Rattus norvegicus reveals a high degree of conservation of both sequence and structural organization. A phylogenetic analysis of AMPD sequences shows that bony fish and mammalian AMPD1s arise by duplication of a common primordial gene.     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

鲫血清转铁蛋白cDNA克隆及系统发育进化序列分析

鱼类血清转铁蛋白是鱼类血清中一种非血红素结合铁的β—球蛋白。从GenBank数据库查询发表的鱼类转铁蛋白cDNA或基因序列,根据铁离子结合及转运功能位点,设计并合成了两对引物P1、P4以及P2、P3,克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA中的核心片段,长度为866bp。再根据克隆出的核心片段分别设计上游及下游两对引物P5、P6以及P7、P8,随后用RACE方法分别克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA的5’端(787bp)和3’端(1081bp)以及全长cDNA,最后在计算机上排列出鲫血清转铁蛋白全长cDNA,长度为2444bp。比较了14种鱼血清转铁蛋白cDNA序列的同源性,其同源性在30％～80％之间,结果显示鲤科鱼类(鲫、银鲫、鲤及斑马鱼等)具有很近的亲缘关系;同时进行了系统发育进化分析,证实了鱼类血清转铁蛋白进化的保守性和氨基酸序列的高度同源性。     

牙鲆胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1 cDNA全长的克隆及表达分析

利用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条鰤、黄金鲈、红点鲑、鲤鱼和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-PCR分析表明,牙鲆IGFBP-1基因存在母源转录本,合子基因在孵化前的胚胎阶段及早期仔鱼中仅有较低水平的表达,在后期仔鱼中表达逐渐增高;牙鲆IGFBP-1基因在肝脏中表达量最高,在胃、脾、肠、性腺、肾、鳃、脑、心脏和肌肉中也有不同程度的表达。