鸡源抗菌肽Folicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定

【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9cm和2.2cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH6.0),每24h补加2%甲醇,29℃培养72h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。     

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【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114 bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170 mg?L-,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9 cm和2.2 cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH 6.0),每24 h补加2%甲醇,29℃培养72 h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。     

牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化

根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组...     

克氏原螯虾i-型溶菌酶在巴斯德毕赤酵母中的高效胞外表达及其抑菌活性（英文）

为开发虾类来源的溶菌酶,本研究建立了利用巴斯德毕赤酵母表达系统高效分泌表达重组克氏原螯虾无脊椎动物型溶菌酶1(简称"pc-iLys1")的方法。经密码子偏好性优化后的pc-iLys1 cDNA在毕赤酵母菌株SMD1168中成功地实现胞外分泌表达,重组蛋白分子质量约为17.1 kDa。在摇瓶中对诱导表达条件进行优化,获得的相对最佳表达条件为:培养基pH 7.0,培养温度28℃,甲醇体积分数1.5%,诱导表达时间96 h。采用该优化条件,进一步利用分批补料策略在5 L发酵罐中进行高密度培养诱导,120 h后获得重组pc-iLys1,其酶活性达到2 052.6 U/mL,最终,酵母干细胞质量浓度达98.1 g/L。抑菌实验表明,重组pc-iLys1对多种革兰氏阳性和阴性细菌均具有明显的抑制活性。总之,本研究实现了克氏原螯虾i-型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达,为其大规模制备打下了基础。     

Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化

选择毕赤酵母表达系统,根据酵母密码子偏爱性合成Ch IFN-α成熟肽的基因序列,连接至载体p PIC9K中,构建重组质粒p PIC9K-α,将重组载体酶切线性后克隆至毕赤酵母GS115,筛选高拷贝转化子及其甲醇利用型,对其表达条件进行优化。结果表明:鸡α-干扰素在毕赤酵母中成功表达,在含2%酸水解酪蛋白,经0.5%甲醇在28℃诱导表达72 h后,重组蛋白表达量最多,抗病毒活性最高。     

有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制

课题内容、目标： 针对当前已分离得到的有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶的缺陷与不足，以蛋白质组学和生物信息学为基础，利用基因重组、定点突变、随机突变、蛋白质分子修饰等手段及蛋白质分子设计技术，结合生物信息学理论，对有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶关键氨基酸残基的分析，并通过理性设计和密码子偏好性改造等，着重对酶蛋白特性进行分子改良，     

来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I     

猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达

根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后...     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。     

棉铃虫葡萄糖氧化酶HaGOX在毕赤酵母中的重组表达和性质研究

毕赤酵母是使用最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一。在毕赤酵母GS115中实现了来源于棉铃虫(Helicoverpa armigera)葡萄糖氧化酶基因hagox的异源表达。以棉铃虫hagox基因连接pPICZαA质粒构建重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115H菌株后得到含有hagox基因的重组酵母菌株。通过平板显色、酶活力测定和SDS-PAGE分析,重组酵母中HaGOX成功表达。HaGOX含606个氨基酸,理论分子量66.9 kD,预测等电点pH 4.78。经测试重组HaGOX的最适pH为6.0～7.0,最适温度为40℃,对6-脱氧-葡萄糖和D-葡萄糖具有高催化活力,以D-葡萄糖为底物的比活力为13.63 U·mg~(-1),对其他吡喃糖和二糖没有催化活力。     

抗甲胺磷单链抗体基因的酵母表达及性质鉴定

为了构建高效表达阳性抗甲胺磷单链抗体(scFv)基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris系统,设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,构建重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris(X-33),抗性梯度筛选转化子以获得高效表达菌株,对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果:获得了稳定高效表达菌株X-33-Pp-Met-28D4-1,该菌株优化条件下的scFv诱导表达量为25 mg/L,纯化产物对甲胺磷的抑制中浓度IC50为93.52μg/mL,抗原抗体亲合常数为2.34×10-8mol/L。因此利用Pichia pastoris表达系统可大量制备功能性抗甲胺磷单链抗体。     

猪hepcidin基因质粒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。     

偏肿革裥菌Lg-mnp1基因克隆及表达研究

[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸（Met）的活性形式。生物体内,SAM由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）[EC2．5．1．6]催化L．甲硫氨酸（L．Met）和A11）反应而合成。酿酒酵母细胞中有2种SAM合成酶的同工酶,即SAMS1和SAMS2,分别由基因saml和sam2编码,二者氨基酸序列的同源性高达92％。在过量L-Met存在下,saml的转录受到抑制;已有酶促法合成研究显示sam2编码的合成酶没有产物抑制现象。笔者将sam2基因连接于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,并通过同源重组整合到酵母染色体上,以实现SAM合成酶的分泌性表达,为开发和建立酶促法生产SAM工艺奠定基础。     

来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]研究植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。[方法]用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyT基因编码区片段,并对该片段进行克隆与序列测定。[结果]序列相似性分析表明,克隆的植酸酶基因无信号肽和内含子,与报道的嗜热真菌Thermomyces lanuginosus植酸酶基因相似性最高,DNA序列相似性为95%。从验证后的转化子筛选得到了表达嗜热真菌植酸酶的重组毕赤酵母菌株p-phy T,SDS-PAGE分析显示其分子量约为45 kD,重组毕赤酵母成功表达植酸酶。与野生型菌株相比,结果显示重组植酸酶酶活性提高了12.6%,最适温度65℃,75℃仍有64%以上酶活活性;最适pH值为5.5。[结论]嗜热真菌植酸酶基因用组成型质粒能在毕赤酵母中表达。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。