羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因的克隆与序列分析

提取羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)总DNA,参考GeneBank中OrfVirus(StrainNZ2)株B2L基因序列设计1对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的B2L基因的片段,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,得到该病毒B2L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV-SAOO、StrainNZ2、OV-IA82、N86.20a、N94.10m、No03.8Rt的B2L基因序列进行比较。结果表明,羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株与StrainNZ2同源性最高,达97.9%,与N86.20a同源性最低,为84.2%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析

本试验通过对羊传染性脓疱病毒内蒙分离株(OV/nm-05)进行总DNA提取,参考GeneBank中OrfVirus(Strain NZ2)株F1L基因序列设计一对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV/7、Strain NZ2、OV/C2、OV/mi-90、OV/Torino、OV/2的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与Strain NZ2同原性最高,达99.1%,与OV/Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和序列分析

参照文献和 Gen Bank发表的接触传染性脓疱皮炎病毒 (CPDV ) NZ- 2株的 Bam H / B片段的基因序列 ,设计并合成 1对引物 ,通过 PCR扩增出国内 CPDV疫苗株和 3个分离株的 B2 L 基因 ,目的片段长约 1.13kb。将目的片段克隆到 p MD18- T载体后进行序列测定 ,并用 DNAStar软件比较分析国内的 CPDV株与 NZ- 2株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果表明 ,国内疫苗株和 3株分离株的核苷酸序列同源性分别为 99.7%、96 .9%和 97.4 % ,与国外 NZ- 2株的同源性为 96 .1%。国内 CPDV株与 NZ- 2株的氨基酸序列同源性分别为 92 .0 %～ 96 .0 % ,表明CPDV Bam H / B2 L基因变异的幅度小。     

羊口疮病毒陕西分离株B2L基因的克隆、序列分析及原核表达

为了对羊口疮病毒(ORFV)陕西分离株B2L基因进行克隆、序列分析及原核表达,根据GenBank已登录的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列,设计合成一对特异性引物,应用PCR技术扩增ORFV B2L基因,并将目的基因连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒PET28a-B2L,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了ORFV陕西分离株B2L全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株B2L基因与国内外已报道的ORFV毒株核苷酸同源性超过97.3%,氨基酸同源性超过95.0%。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为42ku的重组蛋白,该蛋白能与羊口疮阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为ORFV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研制ORFV单克隆抗体及抗体检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

羊传染性脓疱病毒松原分离株的分离鉴定及B2L基因的克隆与序列分析

利用原代犊牛睾丸细胞从临床上表现口疮症状的羔羊痂皮材料中分离获得1株病毒,对该株病毒进行病毒形态学、理化学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为()RFV-sy.利用PCR方法克隆出其B2L基因,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与6个不同来源的ORFV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析.结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.8%～99.5%和97.6%～99.5%;系统发育进化树结果表明,ORFV-sy毒株与印度分离绵羊株ORFV-Mukteswar 67/04、ORFV-Izatnagar 79/04的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的B2L基因差异不大.     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已经发表的羊传染性脓疱病毒毒株StrainNZ2的VIR基因序列,设计合成1对引物。采用PCR技术对内蒙古分离株（OV/nm-05）的VIR基因进行特异性扩增,然后将其克隆到pEASY-T1载体中进行测序,得到该病毒的VIR基因序列。序列分析表明,OV/nm-05株与1710/03株的同源性最高,达98.0%;与513/04株的同源性最低,为95.4%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因与其他参考毒株之间差异不大,这为进一步从分子生物学角度了解VIR基因的结构和功能奠定了基础。     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

1株长春地区羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及F1L基因的克隆与序列分析

利用MDBK细胞从长春郊区一养羊户送检的出现典型"口疮"症状的病羊唇部痂皮中分离获得1株病毒,通过电镜观察、理化学测定、PCR检测、动物回归试验、间接免疫荧光(IFA)及病理组织学观察等方法对该株病毒进行了系统鉴定,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV),命名为ORFV-cc。参照GenBank中ORFVF1L基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,成功地对ORFV-cc株F1L基因进行克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,获得的ORFV-cc分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与ORFV-NZ2,ORFV-7,ORFV-20,ORFV-C2,ORFV-mi-90,ORFV-Torino株核苷酸序列同源性分别为97.5%,98.3%,97.9%,98.5%,98.4%,97.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%,97.2%,97.5%,98.8%,98.8%,97.9%。系统发育进化树结果表明,ORFV-cc分离株与参考毒株ORFV-C2和ORFV-mi-90的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的F1L基因差异不大。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4，用RT-PCR法对新城疫病毒(NDV)V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约4．1kb的V4LA片段，用V4L3、V4L4扩增出约3．5kb的V4LB片段，分别对克隆出的2个片段进行序列测定，并用DNAsis软件比较分析后进行拼接，得到长约7．2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为6704bp，拥有1个6615bp的开放阅读框，推测其编码的氨基酸数为2204个。氨基酸同源性分析表明：V4克隆株与HB92 V4株L基因的同源性为99．0％，与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株)、Beaudette C、Clone30、F48E9、SF02和ZJ1株的同源性为94．1％～96．5％。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及CBP基因的序列分析

根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列,设计合成1对引物,通过对PCR条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了ORFV的PCR检测方法。敏感性与特异性结果显示,最低核酸检测量为1.2 fg/μL,对口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状支原体山羊亚种的扩增结果均为阴性。同时根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列,设计合成1对特异性引物,以ORFV贵州分离株作为模板,成功克隆出ORFV的CBP基因。同源性分析表明,核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的核苷酸序列相似性99.4%～88.8%。本研究为ORFV感染的流行病学调查和CBP基因功能研究奠定基础。     

Isolation and Identification of Orf Virus from Jiangsu Province and Phylogenetic Analysis of Their B2L Gene

The study was aimed to investigate prevalence of Orf virus (ORFV) in Jiangsu province in recent years and control Orf better. A total of 121 tissue samples were collected in some farms from 2013 to 2015 and subjected to PCR detection, viral isolation and phylogenetic analysis of B2L gene. Four samples were ORFV positive by PCR. The viruses were isolated by passaging in ovine fetal turbinate (OFTu) cells and MDBK cells, and were named as ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China, ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China, ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China and ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China,respectively. The B2L gene was amplified and sequenced for the phylogenetic study. The nucleotide homology of these 4 strains was 98.5% to 100.0%. ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China, ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China and ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China, gathered into a cluster with SC-JY, GX-YB, JS-FX isolates and the nucleic acid homology of these strains was 97.8% to 100%. ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China gathered into a cluster with LiaoNing, HuB and Gansu isolates, the nucleic acid homology was 98.8% to 98.9%. The nucleic acid homologies of 4 strains and ORFV strain China vaccine was 96.8% to 98.1%. The result showed that the ORFVs in Jiangsu province might be from different source. For controlling the spreading of this virus, it was necessary to carry out deep epidemiological survey in Jiangsu province.     

江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及B2L基因的遗传进化分析

为了解江苏省近年来羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）的流行情况,更好地控制江苏地区的羊口疮病,2013~2015年采集江苏部分地区羊口疮疑似病料121份,进行病毒分离鉴定及其B2L基因的遗传进化分析。结果显示,样品中ORFV PCR检测阳性4份,用胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）和MDBK细胞进行病毒分离,分离到4株病毒。这4株病毒分别命名为ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。扩增ORFV的B2L基因全长并绘制遗传进化树。B2L基因序列分析显示,4株分离株之间的核酸同源性为98.5%~100.0%。遗传进化树显示,ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China株、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株和ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株与SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇,核苷酸同源性为97.8%~100.0%。ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China与LiaoNing、HuB、Gansu株亲缘关系接近,核苷酸同源性为98.8%~98.9%。4株分离株与中国疫苗株的核苷酸同源性为96.8%~98.1%。结果表明,江苏地区的ORFV来源可能不同,有必要开展更为深入的流行病学调查,为防控江苏地区的羊口疮奠定基础。     

羊口疮病毒GDZC株锚蛋白基因的克隆及序列分析

为研究羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）编码的锚蛋白（ankyrin,ANK）基因在感染宿主中的免疫调节作用,本试验从ORFV GDZC株感染的细胞病毒液中提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增、克隆出5个ANKs基因,并进行了基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析。结果显示,获得的GDZC株ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128、ORFV129基因分别编码516、525、497、501和516个氨基酸,与OV-SA00毒株的核苷酸同源性最高,分别为98.3%、98.7%、97.9%、97.3%、98.0%。ORFV编码的5个ANKs都含有ANK结构域和F-box结构域,是结构保守蛋白。蛋白跨膜分析表明,ORFV123和ORFV128不含潜在跨膜区,ORFV129、ORFV008和ORFV126蛋白分别存在1、2和3个潜在跨膜区,且均不含信号肽。本研究结果为深入研究ANK在ORFV致病过程中作用和免疫逃逸机制提供了基础数据。     

Cloning and Sequence Analysis of Ankyrin Genes from Orf Virus GDZC Strain

To investigate the role of ankyrin proteins encoding by Orf virus (ORFV) in the immune modulation to host infection, five ankyrin (ANK) genes of ORFV GDZC strain were amplified using specific primers by PCR amplification and cloning from the viral genome DNA which extracted from virus infection cells,and their sequences and coding protein structure bioinformatics analysis were performed. The results showed that ORFV008, ORFV123, ORFV126, ORFV128 and ORFV129 consisted of 516, 525, 497, 501 and 516 amino acids, respectively, which shared a nucleotide identity of 98.3%, 98.7%, 97.9%, 97.3% and 98.0% with those of ORFV OV-SA00 strain, respectively. All of five ANK proteins contained ANK and F-box structural domain that showed they were structure conservative proteins. The analysis of protein transmembrane showed that ORFV123 and ORFV128 had no potential transmembrane domains, while the ORFV129, ORFV008 and ORFV126 had one, two and three potential transmembrane domains, respectively. And these ANK proteins had no signal peptide. These results provided the basic data for further study of the ANK proteins in the pathogenic and immune evasion mechanisms of ORFV.     

Cloning and Sequence Analysis of A6L Gene of Goatpox Virus

To explore the molecular characteristics of protein A6 from goatpox virus (GTPV), genomic DNA was extracted from goatpox virus Gulang isolate.The specific primers were designed and used to amplify the A6L gene from the genomic DNA by PCR.A PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector.After transformation into E.coli DH5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed with the bioinformatics softwares.The result showed that A6L gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 1128 nucleotides and deduced protein consisted of 375 amino acids with the theoretical molecular weight of 43.68 ku and isoelectric point of 7.50.Analysis of secondary structure of protein A6 revealed that α-helix, β-strand and random coil were 53.30%, 10.24% and 39.46%, respectively.Analysis of multiple sequence alignment indicated A6L gene from different capripoxvirus isolates were highly conserved with identity of more than 97%.The present results laid the foundation for further studies of biological functions of protein A6 and interaction among the early proteins of capripoxvirus.     

山羊痘病毒A6L基因的克隆及序列分析

为了分析山羊痘病毒A6蛋白的分子特征,本试验提取了山羊痘病毒古浪分离株的基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,克隆A6L基因的DNA序列。将PCR产物连接到pGEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对A6L基因序列进行预测分析。结果显示,A6L基因序列含有1个由1128个核苷酸组成的开放阅读框,编码375个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为43.68 ku,理论等电点为7.50。该蛋白的二级结构中,α螺旋占53.30%,β折叠占10.24%,其余39.46%为无规则卷曲。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株A6L序列高度保守,同源性在97%以上。上述研究结果为进一步研究A6蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...