北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

安淮山羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为了分离得到安淮山羊骨骼肌卫星细胞,成功构建山羊骨骼肌卫星细胞系,为相关研究提供实验材料。以安淮山羊背最长肌肌肉组织为材料,采取胶原酶和胰蛋白酶结合的二步消化法,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞。对骨骼肌卫星细胞中特异性基因Pax7用免疫荧光染色法及PCR扩增加以鉴定。通过分离、纯化,得到纯度较高的山羊骨骼肌卫星细胞,其形态为圆形,折光性强。培养一段时间后密度增大,细胞呈梭型。所得骨骼肌卫星细胞生长状态良好,具有较为一致的生长方式和形态特点。经免疫荧光染色法以及PCR鉴定发现细胞系中有Pax7基因的表达。通过上述材料和方法,可获得较纯的山羊骨骼肌卫星细胞,并稳定传代。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上,而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关,研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限,而共同处理的效果更为显著,虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道,但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制,为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞,在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后,利用CCK-8检测细胞活力;为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制,通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体,并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞,采用qRT-PCR和Western b...     

猪CD127流式单克隆抗体的研制

[目的]研制出猪CD127(调节因子IL-7受体α链)流式单克隆抗体,为研究分析猪淋巴细胞亚群,尤其是猪Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体,也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础.[方法]克隆猪CD127基因片段,通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白,以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体,并采用Western blotting验证所得亚克隆抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合.[结果]猪CD127基因cDNA全长1999 bp,第49~1428 bp为开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸,其中前21位氨基酸为信号肽,成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白,第220~242位氨基酸为跨膜蛋白,第243~459位氨基酸为胞内蛋白.以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大小介于34~43 kD的融合蛋白,经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠,6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对猪淋巴细胞中的CD3阳性细胞(CD3+)进行共标记,其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3+的共标记效果较优,分群清晰;但流式细胞仪检测发现,仅2.3%的CD3+能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,而67.0%的CD3+能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,且分群清晰.从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆细胞株(1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1),且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3+较多,其培养基上清液中的分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD的单一目的条带.[结论]制备获得的猪CD127流式单克隆抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合,同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测.     

Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration

Bone marrow stromal cells (MSCs) have great potential as therapeutic agents. We report a method for inducing skeletal muscle lineage cells from human and rat general adherent MSCs with an efficiency of 89%. Induced cells differentiated into muscle fibers upon transplantation into degenerated muscles of rats and mdx-nude mice. The induced population contained Pax7-positive cells that contributed to subsequent regeneration of muscle upon repetitive damage without additional transplantation of cells. These MSCs represent a more ready supply of myogenic cells than do the rare myogenic stem cells normally found in muscle and bone marrow.     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

Culture and Identification of Myoblasts Isolated from Duck Embryos

Using embryonic myoblasts to research the formation and de-velopmental mechanisms of skeletal muscle is becoming a research hotspot. This study aimed to establish a method of isolation, culture and identification of my-oblasts in duck embryos. [Method] Pectoral and leg muscle samples were isolated from the embryos of Gaoyou duck at 13 d of hatching, then disassociated with col-lagenase and trypsin and purified via differential adhesion. The isolated cells were cultured in vitro and detected for the expression of Pax7 protein using immunofluo-rescence technique. [Result] Myoblasts were obtained successful y both from pectoral and leg muscles in duck embryos and these cells proliferated strongly and differen-tiated wel . Immunofluorescence staining showed that more than 95% cells could express Pax7 protein. [Conclusion] In summary, we report the successful establish-ment of a complete system for the isolation, purification, identification and culture of myoblasts from duck embryos.     

表观遗传调控骨骼肌发育的研究进展（英文）

动物骨骼肌约占体重的50%左右,因此被认为是机体最大的器官。骨骼肌的发育是一个严格调控的过程。在胚胎发育早期,一部分具有肌肉发育潜能的干细胞在一系列不同基因的精确调控下激活、增殖,经融合后形成有功能的骨骼肌。骨骼肌细胞的增殖、分化等过程是诸多转录因子协同作用的结果,这些因子包括Pax3/Pax7、MyoD、Myf5、Myogenin和MRF4等。表观遗传是指不改变DNA序列的情况下对目的基因表达的调控。近年来的研究表明动物骨骼肌的发育也受到了表观遗产的调控。综述了当前关于表观遗传,包括DNA、组蛋白以及miRNA等水平对骨骼肌发育调控的最新研究进展。     

红细胞裂解法及不同培养条件对兔骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

研究采用红细胞裂解液法从兔骨髓中分离BMSCs,相差显微镜观察其形态,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)筛选基础培养液和血清浓度,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学鉴定表面抗原。分离的细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征;在实验范围内DMEM/F12+20%FBS是体外培养兔BMSCs的最佳体系;细胞周期结果显示,BMSCs平均82%处于G0/G1期,18%处于S+G2期;免疫细胞化学结果显示所分离的BMSCsCD90、CD44阳性表达,CD34阴性表达。本研究结果表明,通过红细胞裂解液法分离的兔BMSCs,其具有体外增殖和多向分化的潜能,可以作为组织工程的种子细胞。     

牛乳腺干细胞的分离和生物学特征

为获得牛乳腺干细胞并对其生物学特征进行研究,通过悬浮培养,从体外培养的乳腺上皮细胞分离得到乳腺干细胞球,并通过RT-PCR、Western-blot、免疫组化染色和流式细胞分析对其表面抗原标记特征和分化特征进行研究。结果表明,牛乳腺干细胞表达CD29和CD49f,可以分化为腺上皮细胞和肌上皮细胞。该分离方法增加了获得牛乳腺干细胞的途径,特异性标记物CD29和CD49f可用于其生物学特征研究。     

慢性HCV感染患者外周血淋巴细胞CD8+和CD38+的检测及临床意义

目的通过测定慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者外周血淋巴细胞CD8 、CD38 的表达,从而了解感染者机体细胞免疫状态。方法流式细胞术检测44例慢性HCV感染者及正常对照外周血ALT、外周血淋巴细胞CD8 、CD38 细胞的百分率。结果慢性HCV感染者外周血CD8 、CD38 、CD8 CD38 细胞比例均明显高于正常对照组(P<0.01)。慢性丙型肝炎各组之间比较,ALT异常组CD8 、CD38 、CD8 CD38 细胞比例高于ALT正常组(P<0.01)。结论慢性HCV感染患者CD8 、CD38 、CD8 CD38 细胞比例明显升高,表明慢性HCV感染者处于较高的细胞免疫状态,与肝功能损伤有一定的相关性,对指导临床的病情分析和诊断具有参考价值。     

Effect of MSTN Propeptide and shRNA Co-expression Vector on Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

Myostatin(MSTN)is a negative regulator of skeletal muscle growth,in order to study the effect of inhibition MSTN expression on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,we constructed co-expression vector pcDNA3.1-ProMSTNshRNA,transfected it into muscle satellite cells by Liposome 2000,and detected cell proliferation changes by CCK-8 method and flow cytometry after 48 h.The expressions of P21 and CDK2 were detected by Western blot and real-time PCR.The results showed that the cell vitality of experimental groups significantly increased than that of the negative control,and cells in S phase also increased significantly(P<0.05).After knocked down MSTN gene,P21 expression decreased(P<0.05),but CDK2 gene expression increased(P<0.05).These results indicated that MSTN gene expression was associated with P21 and CDK2,the proliferation of skeletal muscle satellite cells could be promoted while MSTN was inhibited,which provided a theoretical basis for the study on transgenic cattle.     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

鸡白细胞介素-18真核表达载体构建与ILTV弱毒疫苗联合免疫

为了探索鸡IL-18在传染性喉气管炎病毒(ILTV)弱毒疫苗中的免疫佐剂作用,将鸡IL-18(ChIL-18)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pIL-18)。用pIL-18、ILTV弱毒疫苗及其两者联合分别免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。免疫后第4周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果pIL-18与ILTV弱毒疫苗联合免疫组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于ILTV弱毒疫苗免疫组(P<0.01),ILTV强毒攻毒后发病鸡数量少,并且发病症状较轻。     

Caffeoyl Glycoside对脾淋巴细胞生长周期及膜表面标志的影响

用流式细胞术测定了从西藏胡黄连分离的Caffeoyl Glycoside(CG)对小鼠脾淋巴细胞生长周期及其膜表面标志CD4+、CD8+的影响.结果表明:CG通过促进脾淋巴细胞G0/G1期向DNA合成期(S期)转化,从而促进脾淋巴细胞增殖,对脾淋巴细胞膜表面标志的影响,是通过CG上调CD4+、CD8+和CD4+CD8+双阳性细胞亚群,即主要是通过提高Th细胞的数量发挥免疫增强作用.     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

患子宫内膜炎奶牛免疫应答变化规律的研究

利用流式细胞仪及ELISA技术,通过对血液中CD4+、CD8+和血液及子宫分泌物中三种免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)含量进行检测,探讨在炎症状态下,各指标的动态变化与诊断子宫内膜炎的相关性。结果表明,在感染后期CD8+占主导地位,CD4+/CD8+也随之降低。而产后奶牛血液中IgA、IgG、IgM均呈现升高趋势(...     

转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中 肌肉抑制素基因的调控

【目的】构建骨骼肌特异表达目的基因卵泡抑制素（follistatin,FST）的真核表达载体pCFCDs-red和 pSPFCDs-red,分别转染到不同细胞系中,检测FST及下游基因在RNA和蛋白水平的表达情况,同时测定骨骼肌特异启动子SP和α-actin的启动效率,以研究FST的特异表达对肌肉发育的影响。【方法】利用脂质体分别将真核表达载体pCFCDs-red和pSPFCDs-red转染到绵羊胎儿成纤维细胞（SFFCs）、骨骼肌卫星细胞（SMSCs）和SMSCs诱导肌管中,获得转基因细胞;对获得细胞的生长状况、细胞周期、细胞形态大小以及目的基因和下游基因的表达情况,分别用流式细胞仪、实时定量PCR和western blotting等方法进行检测分析。【结果】①转基因细胞系的生长趋势与非转基因细胞相似,转基因SMSCs细胞增殖的速度高于转基因SFFCs细胞;②流式细胞仪分析表明,转基因细胞系转染后70%以上细胞均处于G0/G1期,保持旺盛的分裂能力、具有单一峰值、细胞的整倍性好、细胞电子体积显著增大;③实时定量PCR及western blotting检测结果表明,转基因细胞系中FST的RNA及蛋白水平相比非转基因细胞系均上调;④转基因SMSCs和肌管相比转基因SFFCs细胞的FST表达量高,转pSPFCDs-red转基因细胞中FST的表达水平比转pCFCDs-red细胞系高。【结论】骨骼肌特异性启动子SP及α-actin能够在SMSCs及肌管中有效启动FST目的基因的表达,且在肌管中具有较高的表达量,SP启动子的启动效率较高于α-actin。在肌源性细胞中,FST的上调可以引起MSTN蛋白水平的下调,FST对骨骼肌细胞的生长发育具有一定促进作用。