牛卵母细胞去核方法的研究

哺乳动物胚胎细胞核移植是willadsen 1986年在绵羊上首次采用成熟的卵母细胞做核受体并获得突破性成功.这一研究结果,奠定了哺乳动物核移植的基本技术路线.此后,哺乳动物细胞核移植的研究更加深入和细致.     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

小鼠卵母细胞去核方案的优化

为了优化小鼠卵母细胞去核方案，本研究对比了透明带磨口刺入和透明带直接刺入两种去核方法（分别简称磨口法和刺入法）、蔗糖处理与否、CB的浓度及去核针内径对小鼠卵母细胞的去核效率的影响，及CB浓度对去除部分胞质（不去核）的孤雌胚早期发育的影响。结果：（1）无论是磨口法还是刺入法，添加3％蔗糖和对照组之间的去核成功率及去核操作时间差异均不显著（P>0.05）；（2）CB浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，各试验组的操作时间差异不显著（P>0.05），但10μg/mL的CB操作速度最快，磨口法三个试验组间去核成功率差异不显著（P>0.05），刺入法在CB浓度为5μg/mL、10μg/mL时去核成功率显著高于20μg/mL组（P<0.05），磨口法去核成功率显著高于刺入法（P<0.05）；（3）去除部分胞质的孤雌胚卵裂率各试验组之间差异不显著（P>0.05），20μg/mLCB处理组囊胚率显著低于其它处理组（P<0.05）；（4）在CB浓度为10μg/mL的操作液中，分别用内径为10μm、15μm和20μm内径的去核针，各试验组间操作时间差异不显著（P>0.05），15μm内径的去核针操作速度较快，磨口法去核成功率差异不显著（P>0.05），15μm去核针去核成功率较高，刺入法应用20μm去核针的去核成功率显著低于其它组（P<0.05）。结果表明，磨口法在10μg/mL CB和15μm内径去核针条件下提高了去核成功率(90.8%)及去核速度（50sec/个），且不影响孤雌胚的体外发育率。     

小鼠极体重建卵母细胞的体外受精与发育

本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠（即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠）为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体（COCs）,利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体（PbI）;以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明：注射hCG后12～14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。     

小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育

分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据.     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

亚胺环已酮对小鼠卵母细胞成熟和人工激活的影响

蛋白合成抑制剂亚胺环已酮不能抑制小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中自发的生发泡裂裂ＧＶＢＤ，但可抑制卵母细胞第一极体的释放。刚排出不久和小鼠卵母细胞（ｈＣＧ后１２－１３ｈ）体外老化培养６ｈ，卵母细胞的乙醇激活率达到８６．９％，但如果在老化过程中抑制蛋白质的合成，卵母细胞的乙醇激活率显著下降至１７．４％，亚胺环已酮与乙醇联合使用可有效地激活小鼠ｈＣＧ后１８－１９ｈ的卵母细胞，激活率与乙醇对照组无显著差异     

一氧化氮对小鼠卵母细胞自发成熟的影响及作用机制

为研究一氧化氮（NO）供体硝普钠（nitroprusside sodium，SNP）对小鼠卵母细胞体外自发成熟的作用，并进一步探讨NO影响卵母细胞体外自发成熟的可能机制，我们采用了体外细胞培养方法和放射免疫分析法（RIA）。细胞培养研究结果显示，NO供体SNP（1mM）能够延迟卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs) 自发成熟过程中GVBD的发生，抑制PB1的释放。放射免疫分析（RIA）实验结果表明，1mM SNP能够显著的升高COCs内cGMP的水平，而可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）抑制剂ODQ（10μM）能够消除SNP对cGMP水平升高的促进作用。同时10μM ODQ还能够逆转SNP对卵母细胞自发成熟的抑制作用，而PKG抑制剂KT5823（1μM）却不能够逆转SNP对COCs自发成熟的抑制作用。以上结果说明NO是通过激活sGC，提高细胞内cGMP水平来发挥其作用的，但cGMP下游的PKG信号通路并不参与NO调控的COCs自发成熟过程。     

Forskolin对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟及卵丘扩展的影响

初步探讨了在体外培养条件下ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ对昆明白小鼠卵母细胞成熟和卵丘扩展的影响,培养体系中存在ＨＸ时,ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ能显著促进卵丘－卵细胞复合体（ＣＥＯ）的卵丘扩展,但对其卵母细胞成熟（即ＧＶＢＤ）无明显影响。没有ＨＸ存在时ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ在培养期的１～６小时内可抑制ＧＶＢＤ发生,该作用一依赖性,１０μｍｏｌ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ抑制ＧＶＢＤ,但培养至２４小时,ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ对卵母细     

水牛卵母细胞成熟时间对核移植效果的影响

主要探讨水牛卵母细胞的成熟时间对其体细胞核移植效果的影响,结果表明,在体外成熟(IVM16～24h)期间,不同的去核时间对水牛卵母细胞核移植后的融合率、分裂率和囊胚发育率都没有显著影响(P>0.05),但卵母细胞去核后的注核存活率,IVM16～18h组与IVM22～24h组有极显著差别(P<0.01)。经6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制成熟培养的卵母细胞,再成熟培养16～18h后,与直接在体外成熟培养16～18h的卵母细胞的融合率、分裂率和囊胚发育率相比,均无显著影响(P>0.05)。水牛卵母细胞的成熟时间对其核移植效果无明显影响,6-DMAP可用于调整水牛卵母细胞的去核操作时间。     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.     

小鼠生后不同发育阶段睾丸组织中Crumbs-3(Crb3)的表达

为确定极性调控蛋白Crumbs-3(Crb3)在小鼠(Mus musculus)睾丸组织的定位及其在曲精小管精子发生及间质细胞发育过程中的分布规律,本研究运用常规石蜡切片-HE染色方法和免疫荧光组织化学技术,分别对小鼠生后不同发育阶段睾丸组织结构及Crb3在不同发育时期睾丸组织中的分布进行了研究。结果显示,随着个体发育,曲精小管的直径及生精上皮的厚度不断增大,管腔则由小增大、变小再增大;睾丸曲精小管内生精细胞处于动态的发育变化中,2周龄的生精小管内仅有增殖分裂的数层精原细胞和支持细胞,4周龄时出现各级生精细胞、但无精子形成;之后,继续增殖分裂,至8周管腔内有大量精子形成;并随日龄增加生精细胞密度不断加大;支持细胞的形态随着个体发育逐渐变得清晰而易于辨认;间质细胞则随个体发育体积不断增大、核质比例逐渐下降,而胞质嗜酸性逐渐增强。免疫荧光染色结果显示,Crb3蛋白主要分布在各周龄睾丸曲精小管生精细胞胞膜以及睾丸间质细胞胞膜,且间质细胞上的阳性信号明显强于生精细胞。研究结果提示,Crb3不仅与生精上皮细胞的极性建立和维持有关,而且可能参与睾丸类固醇激素的合成和分泌。     

L-Wnt3a细胞用于制备胚胎干细胞饲养层的研究

小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为胚胎干细胞培养的饲养层细胞,受到细胞代次等因素限制,需要长期反复制备,消耗大量的实验动物。寻找可替代小鼠胚胎成纤维细胞支持干细胞生长增殖的稳定细胞系,对于降低干细胞的培养成本和减少工作量具有重要意义。L-Wnt3a细胞是一个能够稳定向细胞外分泌Wnt3A蛋白的永生细胞系,目前尚不清楚其是否支持小鼠胚胎干细胞的培养。本研究探讨L-Wnt3a作为饲养层细胞对于小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞系的建立以及该细胞条件培养液对无饲养层培养小鼠胚胎干细胞的影响。实验结果表明,丝裂霉素C浓度为10μg/mL,作用4 h时,可显著抑制L-Wnt3a细胞的体外生长而不影响细胞的活力。用该细胞制备饲养层,原代分离、培养小鼠胚胎干细胞,成功建立小鼠胚胎干细胞系。利用L-Wnt3a细胞制备条件培养液进行胚胎干细胞的培养,结果显示,L-Wnt3a条件培养液可支持小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下自我增殖,该条件下培养的胚胎干细胞表达碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、E-cadherin(E-CAD)和SSEA-1多能性因子,并能够在体内、外分化为3个胚层,形成嵌合体后代。L-Wnt3a细胞作为饲养层细胞,能够成功分离获得小鼠胚胎干细胞,可以避免小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞存在的代数限制、制备繁琐等问题;并且LWnt3a条件培养液可以在无饲养层条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,能够在一定程度上有效避免饲养层细胞对胚胎干细胞造成的不利影响。     

不同起始时间超数排卵处理的昆白小鼠排卵、受精和胚胎发育时程研究

超数排卵技术是获得大量卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的主要手段之一。本研究选择发情前期昆白系小鼠(Mus musculus),分别在超排当天的12:00、16:00、20:00和24:00,腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG),随即以1∶1的比例与单笼饲养的公鼠合笼过夜,并于次日清晨检查配种情况。超排小鼠卵母细胞、受精卵和胚胎回收结果表明,在12:00、16:00、20:00和24:00注射PMSG开始超排的小鼠,获取输卵管卵母细胞的适宜时间分别为注射hCG后16.23、14.02、15.93和12.98 h;获取受精卵的适宜时间分别为24.62、23.60、26.53和20.03 h;获取卵裂胚胎的适宜时间分别为42.76、42.39、41.85和40.47 h;获取4-细胞胚胎的适宜时间分别为56.87、57.84、57.31和56.92 h;获取8-细胞胚胎的适宜时间分别为66.89、67.39、66.20和66.07 h;获取桑椹胚的适宜时间分别为76.31、76.21、76.29和75.11 h;获取囊胚的适宜时间分别为100.65、97.14、93.91和96.86 h;获取孵化囊胚的适宜时间分别为114.57、112.34、112.11和110.28 h。在本研究选择的不同时间注射PMSG进行小鼠超排时,超排小鼠的排卵、受精和早期胚胎发育时程基本一致;通过调整超排处理开始时间,可调整超排小鼠卵母细胞、受精卵和不同发育阶段胚胎的回收时间;可以根据不同研究对小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的需要,合理安排小鼠超排起始时间。本研究为以小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎为研究材料的相关研究提供了技术支撑。     

UTX与JMJD3体外转录载体构建及其在小鼠卵母细胞上的验证

UTX(ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat X chromosome)和JMJD3(jumonji domain containing 3)是组蛋白H3赖氨酸27位三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation,H3K27me3)去甲基化酶,可以调控动物机体生长、肌肉发育、调节代谢等重要生理功能.本研究根据小鼠(Mus musculus)UTX和JMJD3 mRNA序列设计3对引物,分别构建了体外转录载体pMD19T-T7UTX和pMD19T-T7JMJD3.分别将体外转录mRNA注射进小鼠卵母细胞,并利用免疫荧光方法对H3K27me3进行检测.转录产物经电泳检测,结果显示,UTX与JMJD3条带清晰与预期大小相符;通过显微注射mRNA的卵母细胞,其H3K27三甲基化修饰明显减少.本研究成功构建了UTX与JMJD3体外转录载体,并在细胞水平证明转录产物能够翻译出具有活性的酶,为利用此载体研究UTX与JMJD3在生长发育及相关疾病发生中的机制提供基础资料.     

供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响

本研究探讨供核细胞处理策略(新鲜消化、-196℃冻存组(复苏后)和曲古抑菌素(TSA)处理组)和TSA-CR1aa胚胎培养液处理时间对克隆胚发育的影响。利用体细胞核移植技术生产奶牛克隆胚胎,将部分克隆胚移植给自然发情同步的受体,检验克隆胚的体内发育能力。结果显示:TSA处理体细胞组的克隆胚卵裂率和囊胚率与新鲜消化和-196℃冻存组相比差异显著(P<0.05);-196℃冻存组与新鲜消化组差异不显著;用TSA-CR1aa分别处理新鲜消化细胞构建的克隆胚0、24、48和60h,其中,60h处理组的囊胚率最高(36.11±1.78%)与其他组对比差异显著(P<0.05);用TSA-CR1aa分别处理TSA处理组构建的重构胚24、48和60h,结果发现,60hTSA-CR1aa处理组囊胚率(37.39±1.78%)最高,显著高于24h(25.48±1.34%)TSA-CR1aa处理组,且差异显著(P<0.05)。将所获得的克隆胚胎分别移植给40头自然发情的受体母牛,并观察移植25,45,65和90d后的返情情况,结果显示,各组受孕率无统计学差异,但经TSA处理细胞和胚胎组移植的受体中,获得一头存活的体细胞克隆奶牛。说...     

母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中的功能

P小体是一种存在于真核细胞质的蛋白颗粒,由多种酶组成并参与mRNA调控.应激颗粒是P小体的一种类似颗粒,是一种在应激情况下形成并由蛋白和RNAs组成的致密集合体,应激颗粒能够暂时性存储mRNA.这两种颗粒在基因转录后调控起重要作用.卵母细胞的成熟是一个持续时间长且复杂的过程.小鼠(Mus musculus)卵母细胞的成熟过程存在转录静默的现象,即小鼠卵母细胞从减数分裂阻滞期(germinal vesicle,GV)到二细胞期不进行任何转录活动.然而,小鼠卵母细胞成熟过程需要大量蛋白的参与.在这一成熟过程中,新合成的蛋白只来源于母源mRNA为模板翻译形成的产物.因此,小鼠卵母细胞对母源mRNA的精确调控在小鼠卵母细胞成熟进程中显得尤为重要.母源mRNA被认为存储于一种类似P小体的信使核苷酸蛋白复合物颗粒里面,本文将这种蛋白复合体称之为母源P小体.本综述对P小体及其功能进行概述,在此基础上着重讨论小鼠卵母细胞内母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中对母源mRNA的调控作用,提出了母源P小体在小鼠卵母细胞成熟调控中发挥作用的可能机制,并提出卵母细胞是一个新颖的研究mRNA转录后调控的模型.     

培养液充气标准气氧气比例及充气时间对小鼠胚胎密闭培养效果的影响

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件,在胚胎密闭培养中,培养液适宜的氧含量对早期胚胎发育至关重要.本研究采用两种氧气比例不同的标准气和两个充气时长,对胚胎培养液进行标准气充气,研究标准气的氧气比例和培养液充气时间对密闭培养小鼠(Mus musculus)2-细胞胚胎体外发育的影响.胚胎密闭培养前,使用由5％O2,5％CO2,90％N2或7.5％O2,5％CO2,87.5％N2组成的高纯标准气对胚胎培养液分别充气120或150 min,以不充气密闭培养和常规微滴培养为对照组.在培养开始后24和48 h检测胚胎过氧化物;培养96和72 h时检测胚胎缺氧诱导因子-1 α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α);培养72和96 h时统计囊胚发育率和孵化率,并进行囊胚细胞计数.结果显示,利用氧气比例为7.5％的标准气对胚胎培养液充气120 min组和充气150 min组的胚胎在培养24 h时能够检测出过氧化物累积;5％O2标准气充气120min,5％O2标准气充气150 min和7.5％O2标准气充气120 min组胚胎,在培养96 h时可检测到HIF-1α阳性,而不充气密闭培养组在培养48 h时即可检测到HIF-1α阳性;5％O2标准气充气120或150 min,7.5％O2标准气充气120或150 min时,密闭培养胚胎均能获得较理想的囊胚发育率和孵化率.培养72 h时,5％O2标准气充气120 min组的囊胚发育率(92.63±0.89)％高于其他3个充气密闭培养组,但无统计学差异(P＞0.05),不充气密闭培养组囊胚发育率(57.04±10.04)％显著低于各充气密闭培养组(P＜0.05),微滴培养组囊胚发育率(98.67±1.33)％显著高于7.5％O2的标准气充气120 min组((87.15±2.35)％,P＜o.05).培养96 h时,各充气密闭培养组及微滴培养组囊胚发育率和囊胚孵化率无显著差异(P＞0.05),但均显著高于不充气密闭培养组(P＜0.05).各充气密闭培养组胚胎体外培养72h后,囊胚细胞数差异不显著(P＞0.05).培养96 h时,5％O2标准气充气120 min组密闭培养胚胎的囊胚细胞数(114.12±3.66)显著高于其他充气密闭培养组和不充气密闭培养组(P＜0.05),与微滴组(110.56±5.24)无统计学差异(P＞0.05).研究结果表明,使用由5％O2,5％ CO2和90％N2组成的标准气对胚胎培养液持续充气120～150min时,可较好地支持密闭培养小鼠2-细胞胚胎发育至囊胚阶段,并完成囊胚的孵化.本研究确定了小鼠2-细胞胚胎密闭培养适宜的标准气O2比例和充气时间,完善了胚胎密闭培养体系,为建立适宜于小鼠早期胚胎空间发育研究的密闭培养体系积累基础资料.     

毛囊特异表达载体pUHS-FGF18的构建及转基因小鼠的制备

成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础.