甜菜SSR-PCR反应体系的优化

为了建立适宜甜菜的SSR反应体系,笔者以甜菜不育系TB005A为试验材料,研究了甜菜SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合甜菜的SSR反应体系为;在20μL反应体系中,模板DNA为60ng,引物（50ng／μL）1．2μL,Taq DNA聚合酶1．0U,dNTPs（2、5mM／L）0．6μL。并利用该反应体系对30个甜菜不同品系进行SSR反应,用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品系间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

甜菜分子标记InDel-PCR引物的筛选

为了筛选出适合甜菜分子标记的InDel引物以及利用InDel引物构建能够扩增多重InDelPCR反应的引物,以提高甜菜InDel-PCR扩增的效率,利用8个甜菜品种的DNA对300对甜菜InDel引物进行筛选,结果筛选出多态性较好、条带清晰、易于识别的甜菜InDel引物44对,这44对引物共扩增出总条带116条,其中多态性条带109条,多态性比率为94%;其中有37对引物扩增的总条带为2或3条,可以作为将来多重InDel引物的首选;又从中筛选出7对多重InDel引物:ND228、ND31、ND267、ND229、ND66、ND231、ND22。     

利用ISSR构建甜菜品种指纹图谱

为了快速、准确鉴定甜菜品种,采用ISSR分子标记对39个甜菜品种进行扩增并构建其指纹图谱。利用8个不同的甜菜品种DNA进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出4条扩增条带清晰、多态性好的引物,对39个甜菜品种进行PCR扩增,构建甜菜品种指纹图谱。结果表明,2条ISSR引物ISSR826和ISSR827扩增条带多态性为71.4%～90.0%(平均85.2%),利用该2条构建的指纹图谱就可以完全区分39个甜菜品种的真实性和纯度。甜菜品种指纹图谱的构建为甜菜品种的鉴定、区分,为科学、快速、高效鉴定甜菜品种,保护科研工作者以及农民的利益提供理论依据。     

棉花SSR标记在红麻中的通用性

红麻与棉花属于锦葵科不同属的天然纤维作物,利用棉花SSR引物的通用性可以丰富红麻SSR标记。本研究从陆地棉每条染色体上随机均匀挑选10对SSR引物,共260对,对24份不同来源的红麻种质进行多态性分析。结果显示,139对(53.5%)引物扩增出了清晰的条带,128对(49.2%)引物表现出多态性,共扩增出292条带,平均每对引物扩增出2.1条带,平均多态信息量为0.5419。表明这些引物在红麻中的通用性和多态性好。位于陆地棉染色体A1、A5和D8上的SSR引物在红麻中扩增多态性较高。聚类分析表明,24份红麻种质可分为2个类群,进一步划分为4个亚群,与地理来源和系谱关系较一致。这些结果既证实了棉花SSR引物应用于红麻是可行的,又有助于红麻与棉花比较基因组学和遗传育种研究。     

马铃薯SSR-PCR体系的优化与建立

以马铃薯叶片DNA为模板,采用单因素试验的方法,对影响马铃薯SSR-PCR反应体系的主要成分模板DNA、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度及退火温度进行了优化,并建立最优化的马铃薯SSR扩增反应体系。结果表明:在20μL反应体系中,模板DNA用量为60 ng,dNTP为0.3125 mmol/L,引物浓度为2.4pmol,Mg2+为1.5 mmol/L,Taq酶为0.5 U,筛选各引物最适宜的退火温度,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增条带清晰,优化后的SSR反应体系稳定性好,可用于马铃薯遗传多样性分析。     

利用SSR荧光标记毛细管电泳法检测蝴蝶兰组培突变体

以8份蝴蝶兰种质资源为材料,使用SSR标记进行蝴蝶兰种质资源和突变体的鉴定。从25对SSR荧光标记引物中筛选出10对扩增效果理想的SSR荧光标记引物,鉴定4个不同品种的蝴蝶兰及其相应的突变体。10对SSR引物中有9对引物在这8个种质中能扩增出多态性条带,共扩增出38个等位基因,利用其中3对引物SSR3+SSR8+SSR9的组合即可将4个品种及其突变体全部区分开,说明SSR荧光标记毛细管电泳法检测蝴蝶兰突变体高效可行。     

2个杂交籼稻和2个粳稻品种SSR指纹图谱的构建及双重PCR技术的初步研究

 用460对水稻SSR引物对5个杂交籼稻及其双亲和16个粳稻品种（系）进行了PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳,筛选出12对稳定性好、多态性高、杂带少的SSR引物作为核心引物,构建了国稻6号和两优培九的SSR指纹图谱。另外,还筛选出9对核心引物,构建了粳稻品种盐稻8号和徐稻4号的分子指纹图谱。其中,筛选出国稻6号的特异性标记5个,两优培九的特异性标记3个,盐稻8号的特异性标记1个,徐稻4号的特异性标记2个。这些特异标记可用于种子纯度的快速鉴定。另外,挑选扩增条带稳定、特异性较好的引物组合,进行了双重PCR分析。     

适于玉米SSR核心引物的通用PCR扩增反应程序的建立

通过研究退火温度与引物TM值之间的关系,确定玉米核心引物设计时对TM值的特殊要求,通过比较3种PCR扩增程序,确定两步法扩增作为新设计引物的统一的PCR反应程序,为基于玉米SSR核心引物构建多重PCR组合反应进行高通量的基因分型奠定了基础。     

甜菜DAMD引物筛选及品种快速鉴定

为了筛选适用于甜菜品种鉴定的DAMD分子标记,建立高效的甜菜品种鉴定方法,利用从文献中获得的29条DAMD引物对40个甜菜品种进行PCR扩增。结果表明:URP1F、OGRB01、URP4R、URP2R、URP6R、URP13R、URP32F、URP17R具有高多态性,8条引物总计可以扩增101条带,其中99条为多态性条带,多态性百分比为97.22%,可确定为鉴定甜菜品种的核心引物。根据扩增产物,可采用特征谱带法,单独使用引物URP6R或引物URP1F和引物URP17R共同使用鉴别40个甜菜品种。同时根据扩增产物建立0、1数据库计算出品种间遗传距离范围为0.01～0.25,在遗传距离为0.25时,可将40个甜菜品种分为2个类群。类群之下可分成多个亚群,通过遗传距离建立的聚类图也可将甜菜品种逐一鉴别。研究表明基于DAMD引物建立的高多态性指纹图谱对今后鉴别甜菜品种的真实性提供了高效快捷的方法。     

茶树多态性SSR分子标记引物筛选

本实验采用国家鉴定茶树品种丹桂自然杂交F1代12个新品(株)系DNA为模板,对60对茶树SSR分子标记引物进行筛选,其中12对引物PCR产物电泳结果较为理想,条带清晰、多态性丰富。其他48对引物没有多态性,或者条带模糊无法统计,或者扩增不出任何条带。从已筛选出的多态性引物中随机挑选2对引物D02、D08,对丹桂自然杂交FI代59个新品(株)系做PCR扩增,电泳检测能获得条带清晰、多态性丰富的胶图,说明筛选获得的12对多态性SSR引物可用于遗传多样性或亲缘关系等分子生物学实验。