逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

用于转导猪β-干扰素基因的高滴度逆转录病毒的制备

通过 DNA重组技术 ,将卵清蛋白 5′调控序列和猪 β-干扰素基因重组到逆转录病毒载体 p L NHX中。通过瞬时转染法 ,将构建好的逆转录病毒重组载体和表达 VSV- G膜蛋白的表达载体 p VSV共转染 GP2 2 93包装细胞。病毒滴度测定表明 ,利用瞬时转染法可以产生高滴度的逆转录病毒 ,最高滴度可达 10 7CFU/ m L。     

猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV）石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术（FACS）分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性.     

逆转录病毒载体的研究进展

基因传递技术被广泛应用于基因治疗、基因改造等领域,其中逆转录病毒载体由于其遗传的稳定性、转染的高效性而得到迅速地发展。作为传递基因的工具,打靶到特定组织和细胞的能力、效率、目的基因的表达情况及生物安全性问题都值得深入探讨。文章从逆转录病毒的分类和基因结构、载体的发展历程、构建特点等几方面进行了阐述。     

重组逆转录病毒载体的包装

将3.7kb的LacZ基因片段克隆到含标志基因Neo的逆转录病毒载体，pLXSN与pLNCX的多克隆位点，构建了含有LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLLSN和pLNCL.在测定了G418对饥装细胞系PA317的最小致剂量后（最小致死剂量为0.3g/L），通过脂质体Lipofectin与磷酸钙2种介质，分别将2种重组逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317进行包装，并以0.3g/L，的G418进行筛选，得到多个G418抗性克隆，经扩大培养，传代，分别得到包装pLLSN与pLNCL的2株阳性细胞，电镜下可见阳性细胞的培养上清中具有逆转录病毒形态特征的成熟病毒粒子，本0研究为运用逆转录病毒载体系统，解决转角因效率低的问题奠定了基础。     

蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体构建与检测

利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中.     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立

根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。     

亚洲1型口蹄疫病毒反义核酸双向表达载体的构建

用RT-PCR法得到针对FMDV基因组5′非编码区反义基因片段及P12A结构蛋白基因和3C蛋白酶,分别克隆到T载体,测序分析正确后,再将它们分别亚克隆到逆转录病毒载体pQCXIX的克隆位点Ⅰ和Ⅱ中,经酶切和PCR鉴定与测序分析,表明目的基因已正确插入表达载体,构建成了口蹄疫双向表达载体pQC-AS-P12A3C。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法，用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317，经G418筛选，获得数个稳定的产毒细胞克隆，择优挑选7个细胞克隆扩增培养，收集细胞上清，用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA，进行逆转录套式PCR，检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价，同时用传统方法（小鼠成纤维放大法）进行测定。2种方法检测结果的比较表明，逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法，是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

应用于兽用疫苗研发的病毒载体研究进展

对应用于兽用疫苗研发的病毒载体,包括痘病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、副粘病毒载体、弹状病毒载体、甲病毒载体、冠状病毒载体、反转录病毒载体、黄病毒载体等DNA和RNA病毒载体的研究进展进行了综述,以期为我国基因工程活载体疫苗研发工作提供参考.     

Expression of HIF-1α ODD domain fused canine caspase 3 by EGFR promoter-driven adenovirus vector induces cytotoxicity in canine breast tumor cells under hypoxia

Adenovirus (Ad) vectors are widely used in cancer gene therapies. However, compared to human patients, relatively limited information is available on gene transduction efficiency or cell-specific cytotoxicity in canine tumor cells transduced with Ad vectors. Since epidermal growth factor receptor (EGFR) is highly expressed on canine breast tumor cells, we sought to develop an Ad vector based on the RGD fiber-mutant adenovirus vector (AdRGD) that expresses canine caspase 3 under the control of EGFR promoter. The aims of this study were to achieve high transduction efficiency with transgene expression restricted to canine breast tumor cells. Using EGFR promoter-driven AdRGD, we were able to restrict transgene expression to canine breast tumor cells with no evidence of expression in normal cells. Canine breast tumor cells transduced with EGFR promoter-driven AdRGD carrying canine caspase 3 gene showed cytotoxic activity. We constructed a second AdRGD vector that expressed oxygen-dependent degradation (ODD)-caspase 3 under the control of the EGFR promoter; the fusion protein contains a core part of the ODD domain of hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-1α) fused to caspase 3. Transduction of canine breast tumor cells with EGFR promoter-driven AdRGD expressing ODD-caspase 3 induced a higher rate of cell death under hypoxic conditions compared with under normoxia. The results indicate that the EGFR promoter-driven AdRGD vectors will be of value for tumor-specific transgene expression and safe cancer gene therapy in dogs.     

小反刍兽疫病毒H、F基因转基因苜蓿表达载体的构建

为了有效预防小反刍兽疫,试验以pBI121为载体,PPRV-H、PPRV-F为目的基因,并插入绿色荧光蛋白(GFP)基因、MAR序列,构建5种小反刍兽疫病毒(PPRV)苜蓿表达载体。结果表明:成功构建小反刍兽疫表达载体,再将表达载体转入苜蓿,饲喂动物,选择其中免疫效果最好的表达载体,为该病的预防工作提供有效的技术支持。     

Effect of Transgene Introduction and Recloning on Efficiency of Porcine Transgenic Cloned Embryo Production In Vitro

Retrovirus-mediated exogenous gene transfection of somatic cells is an efficient method to produce transgenic embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT). This study evaluated whether efficiency of transgenic embryos production, by SCNT using fibroblast cells transfected by retrovirus vector, is influenced by the introduced transgene and whether recloning could further improve its efficiency. Transgenic cloned embryos were produced by SCNT of porcine foetal fibroblast cells transfected by either LNβ-Z or LNβ-enhanced green fluorescent protein (EGFP) retrovirus vector and evaluated for their developmental ability in vitro . Blastomeres from four-cell stage porcine embryos, produced by SCNT of foetal fibroblast cells transfected with LNβ-EGFP retroviral vector, were subsequently recloned into enucleated metaphase II oocytes and evaluated for changes in chromatin configuration, in vitro embryo development and gene expression. Analysis of results showed that cleavage and blastocyst rates of porcine SCNT embryos, using LacZ (53.6 ± 6.4%; 12.0 ± 5.7%) or EGFP (57.5 ± 6.3%; 10.1 ± 4.1%) transfected fibroblasts, did not differ (p > 0.05) from those of non-transfected controls (60.9 ± 8.2%; 12.3 ± 4.0%). Recloning of blastomeres did not further improve the in vitro development rate. Interestingly, the nuclei of blastomere underwent slower remodelling process than somatic cell nuclei. Both cloned and recloned embryos showed 100% transgene expression and there were no evidence of mosaicism. In conclusion, our data shows that the efficiency of transgenic cloned embryos production by SCNT of somatic cells transfected with replication-defective retrovirus vector is not influenced by the transgene introduction into donor cells and recloning of four-cell stage blastomere could not further improve its efficiency.     

犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究

本研究根据酵母系统密码子的偏嗜性,对成熟蛋白基因核苷酸序列进行密码子偏嗜性改造,利用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC来表达犬IFN-α成熟蛋白基因。并采用非洲绿猴肾细胞(Vero) -水疱性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法为基础来测定重组犬α干扰素的效价,同样方法测定了表达产物对PRV和CDV的抑制作用。本试验实现了犬α干扰素在酵母中的高表达,表达量高达58 mg/L,SDS-PAGE检测大小约为24 ku,比预测分子质量大,推测发生了糖基化。表达产物具有较强的种属特异性,在Vero细胞上对PRV具有较高的抗病毒活性,达到了3.6×10⁷ U/L,对CDV也有很好的抑制作用。本研究为犬IFN-α以后的临床应用研究奠定基础。     

基因治疗中的非病毒型载体研究进展

基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。由于病毒型载体存在安全性问题,目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。非病毒载体是新兴的基因转导系统,具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制,以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备,安全性高,却难达到质控要求,体内基因导入效率低,且无靶向性,使得其应用受到限制。pH一敏脂质体、阳离子脂质体等大大提高了脂质体的转运效率。同时高分子载体、纳米基因转运体在基因治疗中的应用,也为非病毒载体在临床上的应用开辟了广阔的前景。     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。