应用单克隆抗体对副结核分枝杆菌抗原性的研究

通过四次细胞融合,获得了5株产生抗副结核杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将这5株单克隆抗体与13株副结核杆菌抗原进行ELISA,结果表明,13株副结核杆菌可初步被5株单克隆抗体分成三组:C_1、C_3、P_(10)、Teps为A组;C_2、C_4、C_5、C_6、C_8、C_(11)、C_(12)、1555为B组;P_(18)为C组。     

应用免疫转印技术分析副结核分枝杆菌胞浆蛋白的抗原性

应用免疫转印技术,着重对副结核菌P_(18)株胞浆蛋白抗原性进行了分析,并比较了不同菌株P_(18)、P_(10)Tcps、316F、2E、Ⅱ(国际标准株)、P_3、(吉林地方株)和8302(延边地区分离株)胞浆蛋白以及P_(18)、P_(10)株培养滤液中蛋白成份的抗原性;另外,对不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白各组分的抗体应答反应性进行了比较。结果表明,P18株胞浆蛋白中的66.2～92.5、60.3、53.7、51.3、25.9～40.7、25.4和24.6Kd的蛋白质分子对S_6号副结核阳性血清发生反应,其中以24.6Kd蛋白质分子的抗原性最强。不同菌株的胞浆蛋白和培养滤液蛋白具有相同的抗原性。不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白抗原各组分的抗体应答反应不同。     

抗鸡IgMμ链单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以原核表达鸡Ig Mμ链蛋白免疫BALB/c小鼠,取3次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选克隆,获得2株分泌抗鸡Ig Mμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1H2、1D10)。这2株杂交瘤细胞株连续传代4个月,并经液氮冻存5个月后复苏培养,仍能稳定地分泌特异性Mc Ab。1H2、1D10腹水ELISA效价分别为1:10~6、1:10~7,亚类鉴定均为Ig G1κ型。间接ELISA检测显示,这两株单抗均与鸡血清中的天然Ig M发生特异性反应,可用于鸡血清中Ig M的快速检测,对于各种传染病的早期诊断具有重要意义。     

藏药刺柏HPLC指纹图谱及穗花杉双黄酮含量测定

试验旨在建立藏药刺柏的HPLC指纹图谱,运用2种统计方法分析不同产区的刺柏药材质量差异。采用HPLC-DAD技术,色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱,以乙腈为流动相A,0.1%磷酸为流动相B,梯度洗脱,建立刺柏药材的指纹图谱并对指标性成分进行测定含量。对6批不同藏药刺柏进行相似度评价,并运用聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)对HPLC指纹图谱进行分类分析。结果表明,刺柏药材HPLC指纹图谱共有峰16个,对14号峰进行指认为穗花杉双黄酮;6批刺柏药材的相似度均0.90;CA将不同产地刺柏药材分为3类,反映了6个不同产区刺柏药材的质量特征;PCA结果显示前4个主成分的累积贡献率达到96.13%,6个化学成分代表刺柏药材质量。说明建立的HPLC指纹图谱结合含量测定、CA、PCA方法可有效控制刺柏的质量,为药材质量控制提供科学依据。     

白头翁汤剂的HPLC指纹图谱研究

为了研究70%乙醇提取白头翁汤剂的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,进一步验证提取工艺的稳定性,为其质量控制提供依据,为后续成分分析及表征奠定试验基础,试验采用8倍处方量70%乙醇,回流1.5 h,提取2次;采用HPLC法,检测波长为205 nm,以小檗碱(15号峰)为参照峰,测定10批白头翁汤的色谱图。共标定了16个共有峰,10批白头翁汤与对照指纹图谱的相似度均大于0.98,通过对照品指认了5个共有峰。结果表明:建立的白头翁汤剂的HPLC指纹图谱方法稳定、可行。说明该方法可用于70%乙醇提取白头翁汤剂的质量控制。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株的选育

用早熟选育方法对堆型艾美耳球虫保定株进行了12代早熟选育,获得了潜隐期为74h的P_9株和62h的P_(12)株两个早熟株.两个早熟株不经选择传递2代,仍保持了早熟的特性.早熟株较其亲代株繁殖能力下降,致病力降低,但仍然保持了良好的免疫原性.早熟选育改变了虫体的内生性发育过程,引起了潜隐期的缩短.P_9株的裂体生殖为3代,P_(12)株的裂体生殖为2代.     

表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株的构建与免疫效力评价

为构建表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株,本研究将冰核蛋白(INP)作为展示平台,将目的基因克隆于构建的pET-INP表面展示载体中,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对目的蛋白的表达与定位进行检测。将110只雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组(30只),INP-28a对照组(30只),INP-MAP3007重组菌免疫组(30只),空白未攻毒组(20只),其中对照组INP-28a与重组菌INP-MAP3007免疫组以5×10~5cfu/200μL/只剂量分别免疫INP-28a空菌与INP-MAP3007重组疫苗,PBS组注射等体积PBS,3免后以5×10~8cfu/只进行副结核分支杆菌K-10株攻毒试验,空白未攻毒组不做处理,通过检测各组小鼠抗体水平、细胞因子、CD4~+和CD8~+T细胞亚群、增重率以及肠、肝脏和脾脏的病理损伤综合评价疫苗的免疫效果。结果显示,目的蛋白MAP3007正确表达且定位于细菌表面;经3次免疫后疫苗组与其他对照组相比能产生较高的抗体水平(p0.001);攻毒后与其他对照组相比,疫苗组小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4极显著升高(p0.001),同时抗炎性细胞因子IL-10降低;疫苗组CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量极显著增加(p0.001),且疫苗组小鼠体重增长速度与未攻毒组基本一致;病理组织学结果发现疫苗组各器官病变情况相对较轻或无显著病变。上述结果表明表面展示活载体疫苗能够诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫进而提供较好的免疫保护,且可以降低其病理损伤程度,减缓病程。本研究为新型副结核杆菌疫苗的研制奠定了基础。     

鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗基础种子代次鉴定试验初报

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗基础种子批的代次。本研究将鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)在SPF鸡胚上连续传至15代,初步确定第10~15代为基础种子批,对10~15代进行了无菌检验、病毒含量测定、血清学特异性试验。试验结果表明:10~15代鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)无菌,各代次病毒含量稳定(107.3~107.7 ELD50/0.1mL),血清学特异性未发生改变。因此,确定鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)10~15代为鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗毒种的基础种子批。     

2株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定与S1、M和N基因序列分析

为跟踪了解广东地区鸡传染性支气管炎病流行情况,2019年从广东省清远、惠州两地疑似鸡传染性支气管炎发病鸡群中采集分离到2株传染性支气管炎病毒,并对其进行了鉴定和分析。结果显示,在鸡胚上盲传3代后均出现鸡胚的典型病变,死亡鸡胚全身出血明显,未死亡鸡胚发育受阻,呈明显的侏儒胚、蜷缩。将2个分离株分别命名为CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225,分别测定其半数感染量(EID_(50)),扩增其S1、M和N基因核苷酸序列,获得相应的推导氨基酸序列并对其分析。分离株CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225的EID_(50)分别为10~(-7.5)/0.1 mL和10~(-6.75)/0.1 mL,2个分离株S1基因与Mass型等疫苗株同源性为76.2%～82.1%,同源性均较低。与H120疫苗株相比,2个分离株的S1、M和N基因存在若干氨基酸的差异,2个分离株S1基因均存在氨基酸的插入,分离株CK/CH/GD/QY1119的M基因存在氨基酸的缺失,分离株CK/CH/GD/HZ1225的M基因存在氨基酸的插入。进化树分析显示,2个分离株分别属于LDT3型分支和QX型分支,均在S1、M和N基因进化树上的分属上存在差异。结果表明本次分离得到的2个分离株的S1、M和N基因均存在不同程度变异,在临床防控中应引起重视。本试验为鸡传染性支气管炎的有效防控提供了参考依据。     

绵羊副流感病毒3型PE2019株的分离与鉴定

为了确定引起绵羊呼吸道传染病的病原,本研究于2019年对一患急性呼吸道疾病死亡绵羊的病料进行了病毒分离,从其胸腔积液中分离到一株绵羊副流感病毒3型(OPIV3),命名为PE2019株。该病毒能够在MDBK细胞上增殖,产生细胞圆缩、集聚成簇等为特征的细胞病变;电子显微镜观察可见OPIV3 PE2019株为直径约300 nm的圆形粒子;经检测该分离株病毒滴度为10~(7.8)TCID_(50)/mL。分离株对小鼠和豚鼠的红细胞血凝价均为164,不凝集鸡、兔、绵羊和牛的红细胞。参考山羊副流感病毒3型全基因组序列(MK091103),设计其N和M基因特异性引物,通过RT-PCR可从病毒细胞培养物中扩增到特异性片段,对其进行序列分析,结果显示,分离株N基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为84.0%、82.1%和78.8%,M基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为81.5%、78.4%和77.6%,OPIV3 N和M基因均为独立一个分支。本研究首次于国内分离到OPIV3,为了解国内OPIV3的流行情况及疫苗的研制奠定了基础。     

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F386、584C9、4G7F4和4C9D8.4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:10~5～1:10~6,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应.MAb 4F386和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM.Western blot检测表明,4F386与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPW的HN蛋白发生特异性反应,而584C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应.4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性.本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件.     

3份长穗偃麦草种质的体细胞核型分析

采用根尖压片法,对不同国家来源的3份长穗偃麦草(Elytrigia elongata)种质材料的体细胞染色体核型进行分析,旨在为其细胞学特性和系统演化的研究奠定科学基础.结果表明:来源于中国新疆的EE001细胞染色体相对长度组成为1L+ 17M2+ 15M1+ 2S,核型公式为K(2n)=10X=70=50m+ 16sm+ 4st;来源于德国的EE014细胞染色体相对长度组成为3L+ 14M2 +13M1 +5S,核型公式为K(2n)=10X=70=48m+20sm+2st;来源于葡萄牙的EE020细胞染色体相对长度组成为5L+ 11M2 +15M1 +4S,核型公式为K(2n)=10X=70=38m+ 22sm+ 8st+2t.3份长穗偃麦草种质的体细胞染色体核型均为“2B”类型.     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活 疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫程序研究

设计不同的免疫程序,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡,通过对ND、IB、H9抗体滴度监测,探讨ND、IB、H9抗体消长规律及鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)的免疫程序。试验结果表明,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡后,其诱导产生的ND、IB、H9抗体的消长规律基本同步;仅于10日龄免疫一次三联灭活苗,其抗体水平较低,于20、40日龄二免、三免或10日龄先用鸡新城疫病毒(La Sota株)、禽流感病毒(H9亚型,SS/94株)二联灭活疫苗作基础免疫,20或40日龄再用三联灭活苗作加强免疫,则上述3种抗体均快速上升,且维持时间长。根据试验结果,建议按照正常免疫程序作基础免疫的健康肉鸡,饲养期较短的可于20日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.3 mL/只;饲养期较长的则于40日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.5 mL/只。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的安全性和有效性

为研究鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)(以下简称"三联苗")的应用效果,使用14日龄AA肉鸡和210日龄蛋鸡进行安全性和有效性研究.安全性研究结果表明,三联苗免疫肉鸡后鸡群精神、采食等状况无任何异常,注射部位无溃烂、肿胀、发炎等症状,各时间点体质量与对照组无明显差异...     

吉林省鹿源牛分枝杆菌MIRU分型研究

为了解鹿源牛分枝杆菌(M.bovis)基因多态性,初步建立适合吉林省鹿源M.bovis的基因分型方法,本研究利用12个分枝杆菌散在重复单位(MIRU)位点,对96株鹿源M.bovis吉林分离株进行MIRU基因分型研究.结果显示,12个位点中有8个位点(MIRU2、4、16、23、27、31、39及40)具有多态性,可以将96株菌株分为1 1个基因型,分辨力指数(H)为0.893,其中6个中度多态性位点的分辨力为0.877.其余4个位点(MIRU 10、20、24及26)未显示多态性.研究结果表明,鹿源M.bovis与其他宿主来源的M.bovis在基因分型上存在差异.MIRU位点对鹿源M.bovis具有良好的分辨力,该分型方法可以作为鹿结核病分子流行病学研究的有效方法.     

中间偃麦草和长穗偃麦草染色体核型分析

选用从国外引进的中间偃麦草(Elytrigia intermedia)和长穗偃麦草(E.elongata)种子为材料,采用根尖压片法进行细胞染色体核型分析。结果表明,中间偃麦草染色体数目为2n=6x=42,染色体相对长度组成为：10L+10M2+12M1+10S,核型公式为：K(2n)=6x=42=34m+8sm,属于“2B”类型。长穗偃麦草染色体数目为2n=10x=70,染色体相对长度组成为:10L+22M2+30M1+8S,核型公式为：K(2n)=10x=70=38m+22sm+8st+2t,属于“2B”类型。本研究结果可以为中间偃麦草和长穗偃麦草的细胞学特性和遗传机制的研究提供理论依据。     

A型猪流感病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型猪流感病毒(SIV)的基质蛋白(M)编码基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测A型SIV的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对H1N1、H3N2和H9N2亚型SIV均呈特异性扩增,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等猪的其他常见病毒无交叉扩增反应;该方法对M基因RNA对照(SIV-M-RNA)的最适线性检测范围为3.8×10~1~3.8×10~8拷贝数/反应,标准曲线方程为Y=-3.4365X+40.091,相关系数(R~2)为0.999 8,最低检出限为38个拷贝数的SIV-M-RNA。对3个不同浓度(3.8×10~3~3.8×10~5 copies/μL)的SIV-M-RNA进行组间和组内重复试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对860份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本进行SIV检测,结果进口猪鼻拭子样本的SIV检测均为阴性,17份国内猪场猪鼻拭子样本SIV检测为阳性。本研究提供了一种快速、敏感和特异的A型猪流感病毒检测方法。     

鸽源新城疫病毒辽宁分离株LNPPMV17全基因测序与遗传演化分析

为了研究鸽源禽Ⅰ型副黏病毒辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。根据GenBank公布的鸽源禽Ⅰ型副黏病毒Pi/SH/CH/0168/2013毒株设计16对引物,对辽宁分离株全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,然后进行序列的比对分析。结果表明:辽宁分离株基因全长15 192 nt,并命名为LNPPMV17。F0裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),结合F蛋白全基因遗传进化分析,辽宁分离株属于ClassⅡ基因Ⅵ型;并发现鸽副黏病毒M蛋白第36和68位点氨基酸与其他禽类副黏病毒有明显不同,这种差异可以作为区别其他禽类Ⅰ型副黏病毒的标志;全基因序列分析结果表明国内鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的同源性较高,这可能是近年来赛鸽业迅速发展,鸽子流通增加,交叉感染所致。     

基于EST-SSR及SRAP标记构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱

苦荬菜是优良的一年生菊科青饲牧草,为构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱,筛选出24对EST-SSR引物、32对SRAP引物组合构建指纹图谱。24对EST-SSR多态性引物对收集的14份苦荬菜品种(系)共扩增出270个清晰条带,多态性条带223个, PIC均值0.834,基因多样性指数变幅为0.2464~0.4288,Shannon指数变幅为0.3597~0.6148,可区分品种3~14个;32对SRAP引物检测到多态性条带367个,PIC均值0.826,基因多样性指数变幅为0.2006~0.3898,Shannon指数为0.3167~0.5716,可区分品种2~12个。7个引物在9个品种(系)上能扩增出特征谱带,综合各项遗传多样性指标筛选出IpSSR102、IpSSR80、IpSSR91、Me10+Em5、Me9+Em17,共5个核心引物的40个多态性条带构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱,每个品种(系)都有一个特异分子身份指纹编码。     

广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析

为探究广西部分地区猪链球菌(Streptococcus suis,SS)流行菌株主要血清型及毒力因子分布情况。本试验于2018年1月至2018年6月对从多个猪场采集到的116份疑似链球菌感染的组织病料(脑、肺脏、淋巴结等)进行病原菌检测,采用细菌分离鉴定、形态学观察及PCR扩增等方法对病原菌及其血清型和部分毒力因子进行鉴定。结果显示,116份样品共分离到链球菌32株,阳性率为27.59%(32/116),其血清型主要以SS2和SS9为主,分离率分别为40.63%(13/32)和43.75%(14/32),其他血清型为15.63%(5/32);毒力因子检测结果表明:SLY、MRP、EPF以及SBP2′因子的检出率分别为:81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、50.00%(16/32)和71.88%(23/32)。32株链球菌中以SLY~+MRP~+EPF~+SBP2′~+(13株)、SLY~+MRP~-EPF~-SBP2′~-(5株)、SLY~+MRP~+EPF~-SBP2′~+(5株)为主要的毒力基因型,其中SS2均能检测出3个或3个以上的毒力因子。玉林、柳州市主要分布SS9型,南宁、百色市主要分布SS2型;广西不同地区毒力因子的分布情况存在差异且不同血清型或同一血清型的链球菌毒力因子的分布情况也各不相同,其中SS2携带的毒力因子检出率明显高于其他血清型。该研究可为今后猪链球菌疫苗及致病机理研究提供理论依据,为广西地区猪场链球菌血清型疫苗选择提供指导。