牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

本试验对牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛最小免疫剂量及攻毒保护效果进行了研究。对BVDV2/JZ05-1活疫苗进行倍比稀释后免疫犊牛,在免疫后第28天用BVDV/JL-1强毒株进行攻毒保护试验研究。结果表明,牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛的最小免疫剂量是105.0TCID50/mL。     

牛病毒性腹泻病毒的检测方法及净化研究进展

牛病毒性腹泻病又称之为牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine vival diarrhea-mucosal disease,BVD),是由牛病毒性腹泻病病毒(Bovine vival diarrhea virus,BVDV)感染引起的一种以腹泻为主的粘膜病。BVDV会破坏牛自身的免疫系统,导致免疫力下降,病牛容易被机会致病菌侵袭,感染其他疾病,造成的经济损失巨大。由于该病流行范围广、危害大。因此,建立准确、高效的BVDV检测方法对于阻断BVDV的传播及实现BVDV的净化具有重要意义。本文对牛病毒性腹泻-粘膜病的检测技术和净化方法进行了简要综述,旨在为规模化牛场提供检测技术参考和BVDV的净化思路。     

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温武多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp.特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA.建立的BVDV和BRV二温武多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法.     

伊犁河谷地区牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定与分析

为摸清伊犁河谷地区牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染的病毒基因型,利用BVDV基因组5′端非翻译区(5′-UTR)通用型引物,采用一步法RT-PCR对疑似感染样品进行基因扩增、序列测定与比对分析以及遗传进化树构建.结果显示:12份疑似样品中,有1份样品PCR扩增结果呈阳性,基因型鉴定为BVDV2型.该研究表明伊犁河谷规模化牛场内存在BVDV2型感染,为该地区规模化牛场病毒性腹泻病的防控提供了理论依据.     

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS5b基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。     

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒河北分离株的生物学特性

【目的】了解牛病毒性腹泻病毒河北分离株HB株的特性,阐明牛病毒性腹泻/黏膜病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据特进行此项试验;【方法】用理化学及生物学方法对BVDV河北分离毒株HB的特性进行检测,与BVDV准毒株OregonC24V株进行比较,分析了其理化性及生物学特性。电镜负染检查可见直径为40￣60nm有突起的圆形或近圆形的病毒颗粒,病毒在蔗糖中的浮密度为1.13￣1.14g/cm3。与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒颗粒相似。毒力测定TCID50为10-4.5。理化学研究表明,该病毒对氯仿、乙醚、胰酶敏感;不耐酸、对碱具有较强的耐受性。牛病毒性腹泻/黏膜病病毒对56℃30min较敏感,56℃70min可使其完全灭活。血凝试验表明,该病毒对鸡、兔、猪和绵羊的红细胞均无血凝性;5-碘脱氧尿核苷(5,-IUDR)不能抑制病毒的增殖,核酸分型试验表明该病毒株基因组为RNA;病毒纯化后经SDS—PAGE电泳出现了5条主要结构蛋白带,与BVDV国际标准毒株OregonC24V株结果一致;【结论】河北分离株HB株为牛病毒性腹泻病毒。     

陕西部分地区梅花鹿BVDV、BCoV和BRV感染情况调查

为了解陕西部分地区梅花鹿感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)情况.从陕西汉中、安康、商洛、咸阳四地6个鹿场采集梅花鹿肛拭子样品共61份,使用反转录PCR技术检测3种病毒感染情况.结果发现采集样品的BVDV、BCoV和BRV感染全部为阴性.以上结果表明陕西梅花鹿群BVDV、BCo...     

牛病毒性腹泻病毒研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)是一个影响养牛业经济发展的重要病原,它能够引发牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhoea,BVD)。BVD是急性和繁殖障碍型传染病,使牛发生病毒性腹泻、发热、黏膜溃疡和白细胞数量减少等症状。文章重点对病毒的分型、E2蛋白结构功能、临床感染类型和防控措施等进行了综述,为该病的深入研究提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用

用增殖与浓缩后的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分别免疫健康牛犊和家兔,制备牛抗BVDV和兔抗BVDV超免疫血清,并用层析法纯化牛抗BVDV IgG和兔抗BVDV IgG,建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA快速检测方法.结果表明:该检测方法的最佳反应条件为:牛抗BVDV IgG包被浓度为100μg/mL,兔抗BVDV IgG最佳工作浓度为50μg/mL,样品反应时间为90min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D490nm≥0.177作为阳性判定标准.该ELISA检测方法的重复性CV小于10%,最低检测限为1.87μg/mL,与牛轮状病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、犊牛大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温下至少可保存6个月.用该ELISA方法和IDEXX公司抗原检测试剂盒对甘肃省不同地区牛场156份临床粪便样品进行了检测,阳性检出率分别为17.3%和16.7%.表明本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性高且重复性好,可用于BVDV的快速检测.     

牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立

根据Genbank发表的牛呼吸道综合征相关病毒中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)N基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR和牛副流感3型病毒(BPIV3)N基因设计特异性引物,建立了在同一体系内同时对4种病毒进行检测的多重PCR方法。该方法可以同时检测出DNA病毒IBRV的长306bp和反转录病毒BPIV3长422bp、BRSV长600bp及BVDV长130bp的特异性片段。本项研究中以已知IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV作为参考毒株,对来自内蒙古、辽宁、安徽和吉林4个省、自治区的33例临床样品进行检测。结果表明,合并感染2种病毒较为多见,分别为BVDV和BRSV共感染,BPIV3和BRSV共感染,BPIV3和IBRV共感染,未检测到4种病毒同时感染临床样品。     

A novel real-time RT-PCR with TaqM an-MGB probes and its application in detecting BVDV infections in dairy farms

A real-time RT-PCR assay using Taq Man-MGB probes was developed to detect and type the bovine viral diarrhea virus(BVDV) in cattle.Universal primers and Taq Man-MGB probes were designed from the 5′-untranslated region of known pestiviral sequences.Prior to optimizing the assay, c RNAs were transcribed in vitro from the BVDV 1 and BVDV 2 RTPCR products to make standard curves.The detection limit of the assay was 1.72×102 copies for BVDV 1 and 2.14×102copies for BVDV 2.The specificity of the assay evaluated on several BVDV strains including bovine herpesvirus 1(BHV 1), foot and mouth disease virus(FMDV) and several classical swine fever virus(CSFV) strains showed specific detection of the positive virus over 40 cycles.The assay was highly reproducible with the coefficient of variance ranging from 1.04 to 1.33% for BVDV 1 and from 0.83 to 1.48% for BVDV 2, respectively.Using this method, we tested a total of 2 327 cattle from three dairy farms for the presence of BVDV persistently infected(PI) animals.In this assay, each RT-PCR template contained a mixture of ten samples from different animals.The occurrence rate of PI cattle in three farms ranging from 0.9 to 2.54% could represent partly the PI rates in cattle farm in China.In conclusion, using our real-time PCR assay, we could effectively detect and type BVDV and identify PI cattle in a rapid and cost-effective manner.     

牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1基础毒株的安全性和免疫原性研究

本试验用已分离到的牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1基础毒株对犊牛免疫的安全性和免疫原性进行了研究。通过对基础毒种单剂量、超剂量、单剂量重复安全试验和免疫原性试验研究证实,BVDV2/JZ05-1对犊牛免疫是安全的,对犊牛感染BVDV有很好的免疫保护效果。     

检测猪源牛病毒性腹泻病毒荧光RT-PCR方法的建立与监测分析

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR保守序列建立的特异性荧光RT-PCR,对采自福州市周边屠宰场的359份屠宰猪血清进行BVDV感染的病原学检测。结果待检的359份血清样品BVDV阳性52份,阳性率为14.5%(52/359)。对其中13份BVDV阳性样品5′端UTR片段进行序列测定分析,发现所测13份BVDV阳性样品5′端UTR片段均与VEDEVAC进化谱系较为密切,均为基因Ⅰ型。以上结果表明以牛源BVDV建立的特异性荧光RT-PCR方法适用于猪源BVDV感染的监测,并揭示福州市屠宰猪存在BVDV感染。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病活疫苗BVDV2/JZ05-1株毒力返强试验

研究了BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛后是否会出现毒力返强现象.以病毒含量为10-7.26 TCID50/mL的BVDV2/JZ05-1活疫苗滴鼻免疫犊牛(4mL/头),通过疫苗回滴,连续临床观察,采集抗凝血和鼻拭子,对淋巴细胞数量变化进行分析,并从淋巴细胞和鼻拭子中分离病毒.结果表明,BVDV活疫苗BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛没有出现BVDV感染的临床症状,淋巴细胞数量正常,鼻拭子和淋巴细胞病毒分离阴性.可见,该毒株对犊牛免疫没有出现毒力返强的现象.     

牛病毒性腹泻病毒地方株的分离与鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻 (BVD)疑似病例中采集病料 ,将处理好的 6份病料接种MDBK细胞 ,并盲传 4代 ,得到了 2株可产生细胞病变的病毒。 2株病毒的TCID50 分别为 10 - 5.59和 10 - 5.51;琼脂扩散试验表明 ,2株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)OregonC2 4 标准阳性血清反应 ,出现沉淀线 ;中和试验表明 ,2株病毒均能被BVDV标准阳性血清中和 ,中和指数分别为 10 3.30 和 10 3.16 ;电镜观察到圆形 ,直径为 4 0～ 6 0nm ,有囊膜 ,囊膜表面有突起的病毒粒子 ,与BVDV颗粒基本一致。因此 ,确定分离的 2株病毒均为BVDV ,分别将其命名为HN - 1株和HN - 2株。     

一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。     

宁夏部分地区犊牛7种腹泻相关病毒的检测及分析

【目的】调查分析宁夏地区规模化奶牛场牛腹泻相关轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛环曲病毒(BToV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)、牛库布病毒(BKV)的感染情况。【方法】用RT-PCR方法对采集自宁夏部分地区的6个规模化奶牛场共计81份犊奶牛腹泻粪便样本进行检测,同时扩增相关基因进行分析。【结果】81份样本中BRV阳性率为16.05%,BCoV阳性率为13.58%,BToV阳性率为2.47%,BKV阳性率为2.47%,BVDV、BAstV、BNoV均无检出。BRV和BCoV的混合感染率为3.70%,BKoV和BToV的混合感染率为1.23%。遗传进化分析表明宁夏地区流行的BRV有G6型毒株,并且BCoV毒株具有不同的遗传进化趋势。【结论】BRV、BCoV仍是宁夏规模化奶牛场内最主要的犊牛腹泻病毒,同时检测到BToV和BKV,丰富了宁夏地区牛腹泻病原谱,为宁夏地区奶牛腹泻的综合防治提供了依据。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研制

将含有牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)囊膜糖蛋白E2编码基因的真核表达质粒pEC143免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组E2蛋白纯化产物为检测抗原,经间接ELISA法筛选和3次有限稀释法克隆,得到1株能稳定分泌抗BVDV1和BVDV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该3D8株单抗能识别BVDV1标准毒株(NADL、OregonC24V)、BVDV2标准毒株(890、104)、2株BVDV1分离株和3株BVDV2分离株,而不能识别牛轮状病毒、牛疱疹病毒1型,显示出良好的特异性.阳性杂交瘤细胞的上清液、腹水ELISA抗体效价分别为2~9和10×2~7,为IgM亚类.其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得,为建立单抗介导的检测BVDV1和BVDV2抗原和抗体的血清学方法和实现标准化诊断奠定基础.