大豆北方茎溃疡病菌荧光RAA检测方法的建立

本文根据大豆北方茎溃疡病菌与其近似种在序列上的差异,设计了特异性的引物和探针,建立了荧光RAA特异性检测方法,并用大豆上常见的病害及其近似种进行验证。结果表明:供试的菌株,只有大豆北方茎溃疡病菌表现出阳性扩增信号,其他菌株和空白对照均未检测到荧光信号,该方法可以检测到1.0×10³ mL^-1的阳性DNA,完成整个检测只需20 min左右,可以快速、灵敏的完成进出境大豆产品的大豆北方茎溃疡病菌的检测。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

利用环介导等温扩增技术检测茶叶中掺杂的大豆成分

采用环介导等温扩增技术,建立了一种快速简便的检测茶叶中掺杂的大豆成分的方法。根据大豆内源基因序列,共设计了6条引物,通过环介导等温扩增技术(LAMP)扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性检测表明,所设计的引物对大豆成分的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示,LAMP方法比荧光PCR方法灵敏度高10倍。通过对反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度和d NTP浓度的优化,本研究建立起优化的反应条件,整个检测周期约1 h,检测结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定,可应用于大批量茶叶样本中掺杂大豆成分的检测。     

番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。     

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大.     

柑橘溃疡病菌环介导等温扩增快速检测技术研究

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测已用于基层植物检验检疫中的疑似样品检测诊断。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)是重要的检疫性病害,根据柑橘溃疡病菌基因组中一段保守序列设计LAMP引物,建立了柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只对柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病病斑总DNA进行扩增,而对非靶标菌DNA和非靶标病斑总DNA不发生扩增,特异性与PCR一致。该LAMP检测方法最低可检出100 pg的纯柑橘溃疡病菌DNA和最低每微升4个细菌,灵敏度均比PCR高了1 250倍。LAMP检测法能很好地区分症状极易混淆的柑橘溃疡病和疮痂病。该试验建立的柑橘溃疡病菌LAMP检测方法具有简单、快速、灵敏和特异等优点,可在条件相对简陋的实验室应用。     

基于ITS序列大豆茎褐腐病菌的PCR鉴定

提取了分别来自11个种共13株真菌(都是大豆上的常见病害的病原菌)的DNA.采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增,并对大豆茎褐腐病菌的PCR产物进行测序.根据所得大豆茎褐腐病菌与其常见易混淆品所在属在ITS区的基因序列比较分析,设计并合成了1对特异性引物.采用此对引物,只有大豆茎褐腐病菌能扩增出500 bp条带,检测的灵敏度达到4.2 pg/μL.将此对引物应用于人工接种大豆茎褐腐病菌大豆的检测,结果表明,此方法能够成功区分大豆茎褐腐病菌及其近似种.     

向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

[目的]建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi(Persoon)Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法.[方法]用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品.[结果]序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97;.针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370bp.[结论]成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法.     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

油菜茎基溃疡病菌LAMP-HNB 检测方法的建立

油菜茎基溃疡病菌是油菜上最严重的真菌病害之一,是我国重要的检疫性有害生物。因此为防范其危害我国油菜产业生产安全,建立油菜茎基溃疡病菌的快速筛查方法具有重要意义。基于环介导等温扩增法(LAMP),以ITS(内转录间隔区)为靶序列并结合指示剂羟基萘酚蓝(HNB)建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的油菜茎基溃疡病菌的快速检测方法,并对其特异性、灵敏性进行评价以及实际样品进行检测。结果显示,该方法在62℃等温条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。LAMP-HNB法与标准PCR检测方法对比显示其具有良好的特异性以及更高的灵敏度,利用该方法对10批油菜籽样品进行检测,共检出5批阳性样品,与标准中PCR检测方法结果一致。该方法的建立为油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定提供了新途径。     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

基于环介导等温扩增技术快速检测瓜果腐霉菌

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。     

检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法.     

环介导等温扩增技术检测油棕猝倒病菌的研究

油棕猝倒病菌是我国进境植物检疫性有害生物。试验应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了一种快速敏感的油棕猝倒病菌检测方法。根据ITS区基因上的8个位点,共设计了6条引物,并对反应条件和反应体系进行优化。特异性试验结果表明,引物对油棕猝倒病菌的检测具有良好的特异性;灵敏度试验结果表明引物最低检出限为0。12 ng·μL-1比普通PCR高100倍;检测结果经SYBR Green Ⅰ染色后,肉眼即可观察结果。该方法能够快速、灵敏、特异地检测油棕猝倒病菌,只需一台水浴锅就可以开展检测,非常适合基层现场检测。     

菜豆晕疫病菌环介导等温核酸扩增检测方法的建立

为了建立菜豆晕疫病菌的环介导等温扩增方法,本试验利用菜豆晕疫病菌arg K特异性序列设计环介导等温核酸扩增(LAMP)引物,进行反应条件和反应体系的优化,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测结果显示,5株菜豆晕疫病菌的LAMP产物呈阳性结果,而参试的其他病原菌不产生扩增反应。LAMP检测基因组DNA和菌悬液时,其灵敏度分别达到0.632×10-4ng/μl和7.3×102CFU/ml,该方法比常规PCR灵敏度高100倍。表明本研究所建立的LAMP检测方法简便、快速、准确、灵敏,可有效应用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

重组酶介导的油菜茎基溃疡病菌荧光核酸扩增检测体系的建立

本文通过重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法。根据油菜茎基溃疡病菌的特异基因LMR1-D保守序列设计引物和探针,分析建立的RAA方法的灵敏度和特异性。该方法在39℃下,反应时间段(<20 min),检测下限可达10拷贝·mL^-1,与油菜黑胫病菌等近似种无交叉反应,具有良好的特异性。本研究建立的RAA方法反应速度快、特异性强、灵敏度高,适用于油菜茎基溃疡病菌的快速检测。     

基于环介导等温扩增技术检测黄淮地区大豆主栽品种种子携带的病原菌

[目的]通过对黄淮地区大豆种子带菌的快速检测,了解该地区大豆种子携带病原菌的情况。[方法]采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测黄淮地区29个大豆主栽品种种子上平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、大豆拟茎点种腐病菌、立枯丝核菌、大豆炭腐病菌、冬青丽赤壳菌、大豆疫霉病菌等大豆主要病原菌的携带情况。[结果]供试的29个品种中有20个品种的种子样本检出携带上述病原菌,分别携带所检测的13种病原菌中的7种,检出率由高到低依次为平头炭疽菌、大豆拟茎点种腐病菌、木贼镰孢菌、黄色镰孢菌、尖镰孢菌、胶孢炭疽菌和层出镰孢菌,但不同大豆品种种子携带病原菌的种类及数量有较大差异,其中品种‘漯39001’检出的病原菌多达6种。[结论]本研究为大豆种子带菌检测提供了新的方法,并揭示了黄淮地区大豆种子携带病原菌的状况,在生产上有较大的应用价值。     

草莓角斑病菌PCR检测研究

[目的]研究草莓角斑病菌的快速检测方法。[方法]根据草莓角斑病菌的hrp基因,设计了1对引物XF-F/R,进行该病菌PCR特异性扩增。[结果]该引物可特异性地扩增草莓角斑病菌的DNA、菌悬液、人工接种样品。[结论]该检测方法特异性强、灵敏度高,可适用于草莓角斑病菌的检测。     

猪·牛·羊源性成分实时等温扩增检测方法的建立

[目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物,通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg,牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时,掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测,可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。     

利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL~(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。