大白菜PAT1基因的克隆及其表达载体的构建

根据GenBank中大白菜（Brassica campestris L ssp．pekinensis）基因组测序结果,分析了大白菜PAT1（phytochrome A sjgnal transduction）基因的内含子和外显子。通过拼接外显子,获得了大白菜PAT1基因的cDNA编码序列。根据编码区序列,设计并合成了一对引物;利用这对引物,采用RT—PCR技术扩增出大白菜福山包头PAT1基因（CcPAT1）的全长cDNA序列。CcPATl编码区共1500bp,与拟南芥PAT1相似性为85．03％。同时构建了含有35S启动子的pCAMBIA-2300-CcPAT1过表达载体,并利用以PAT1 5’端特异区域构建了pFGC-1008-PAT1RNAi（RNA interference）载体,以备将来研究大白菜CcPAT1基因的功能。     

OsWRKY10基因特异性dsRNA干涉载体构建

[目的]明确Osdg中T-DNA插入位点的基因是否为引起突变表型的基因。[方法]采用OsWRKY10基因5’端、不含WRKY保守域的长300 bp的cDNA片段,构建抑制OsWRKY10基因表达的特异性dsRNA干涉重组表达载体pCam-35SWInW。采用冻溶法将pCam-35SWInW载体导入根癌农杆菌超毒力菌株EHA105,对其进行PCR检测。[结果]该研究成功构建了重组表达载体pCam-35SWInW。采用相应限制性内切酶对重组表达载体进行酶切鉴定,其中以XhoⅠ消解重组质粒,可获得1 kb左右的DNA片段。在抑制基因表达方面,发卡结构比反义结构更为有效。[结论]该研究成功构建了抑制OsWRKY10表达的特异性dsRNA干涉载体,可用于进一步的基因功能研究。     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因dsRNA载体的构建及其表达

将中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）外壳蛋白基因（coat protein,CP）同源的部分片段双链RNA重组至植物表达载体pBIN19,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404导入本氏烟（Nicotianabenthamiana）。PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA中,引起与其同源的基因发生沉默,从而可抑制病毒复制,达到抗该病毒的目的,为防治这类病毒病害提供了新的可能。     

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

海岛棉DREB基因的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank上公布的棉花GhDREB1基因序列设计特异性引物,从海岛棉中克隆了一个与DREB类基因同源的cDNA序列,命名为XHDREB。序列分析表明,该cDNA序列长度为651 bp,推测含有216个氨基酸,分子量为24.6 kDa,等电点为9.46。同源性分析表明,它与GhDREB1的氨基酸序列同源性为85.19%。所编码蛋白具备DREB1转录因子的特征:含有58个氨基酸组成的AP2 DNA结合域以及两个DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。然后将XHDREB基因连接到pCAMBIA2300-35SOCS质粒上,构建了植物表达载体。     

白菜细胞核雄性不育基因向菜心品种早-49的转育研究

根据大白菜复等位基因遗传假说,利用现有白菜雄性不育系(99029-2)作为不育源,以早-49菜心品种为目标亲本,经过杂交、自交、测交、兄妹交等转育方法,将核不育基因向菜心品种转育,得到了含有早-49遗传基因的新甲型两用系、临时保持系和雄性不育系。     

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

菜心 BcCIPK23 基因克隆及表达特性分析

【目的】CIPK23 基 因 在 植 物 生 长 发 育 和 矿 质 营 养 吸 收 中 具 有 重 要 作 用, 但 在 菜 心 中 关 于BcCIPK23 基因及其功能的研究尚无报道,该研究可为探讨 BcCIPK23 在菜心植株生长发育和氮代谢中的生物学功能提供理论参考。【方法】以‘油绿 501’菜心为材料,采用同源克隆法克隆到菜心 BcCIPK23 全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析,探究其组织表达特性和对不同氮源的响应。【结果】菜心 BcCIPK23 基因 CDS 全长为 1 450 bp,编码 482 个氨基酸,分子量是 53.41 kD,理论等电点为 9.28,具有 CIPK 家族成员的STKc-SnRK3 和 CIPK-C 保守结构域。系统进化树分析表明,菜心 BcCIPK23 和白菜 BrCIPK23 进化关系最近。BcCIPK23 在菜心叶片、叶柄、薹茎、根系、花等组织中均有表达,但主要集中在叶片、叶柄、薹茎中表达;BcCIPK23 表达也受氮源及其水平的影响,无论供 NO3- 还是供 NH4+,其表达水平均随氮浓度增加而降低。推测该基因在叶片、薹茎发育和氮素吸收利用中发挥关键作用。【结论】菜心 BcCIPK23 为 CIPK 基因家族成员,主要在叶片等生长活跃的器官高表达,且可响应氮源及氮浓度变化,参与植物生长发育和氮代谢过程。     

大白菜果胶甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析

 【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号：HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包含363个氨基酸的前体蛋白。BrPME1蛋白N末端1—23位为信号肽,成熟蛋白含有保守的果胶甲酯酶酶活结构域,而不含酶活抑制位点。预测BrPME1蛋白含有10个磷酸化位点、1个酰胺化位点和6个N端豆蔻酰基化位点。BrPME1在两用系不育株花蕾中表达量很低,在可育株的大花蕾以及成熟花药中高水平表达。【结论】BrPME1是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的果胶甲酯酶基因家族成员。     

大白菜查尔酮合成酶基因BrCHS1的克隆与特征分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮合成途径前期的1个关键酶。本研究从大白菜花瓣中克隆到1个查尔酮合成酶家族基因,命名为BrCHS1。序列比对发现BrCHS1氨基酸序列与其他物种CHS氨基酸序列的同源性多数在80%以上,利用实时荧光定量PCR技术分析BrCHS1在大白菜黄色和白色花各种花器官中的表达水平,结果表明:BrCHS1在黄色花瓣中的表达量远高于其他花器官。以FT50×H1的F2代分离群体为试材,根据BrCHS1周围序列设计SSR1引物,寻找与大白菜白色花基因紧密连锁的分子标记,结果显示,BrCHS1基因与白花性状基因并不连锁。     

Study on Screening of Virus Inhibitor Combinations against Viral Diseases in Chinese Cabbage

选用毒氟磷、香菇多糖等几种病毒抑制剂或钝化剂,设计了15个单独或组合处理,探讨田间防治大白菜病毒病的防治效果。结果表明,毒氟磷、香菇多糖2种单剂单独使用的防治效果较好,防效分别为70.01%、66.02%。该2种药剂组合为毒氟磷＋香菇多糖或者分别与维佳希复配为毒氟磷＋维佳希、香菇多糖＋维佳希均可产生一定的增效作用,其防治效果分别达83.70%、78.07%、82.32%。     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。