沼液对植物病害的防治效果及机理研究Ⅰ：对植物病原真菌的抑制效果及抑菌机理初探

采用菌丝生长抑制和分生孢子萌发抑制的试验方法,以草莓枯萎病菌为靶标病原菌,研究了江苏省内运行稳定的21个大型沼气工程的沼液及其无菌滤液对草莓枯萎病菌的生长抑制特性。结果表明,所有沼气工程的沼液对草莓枯萎病菌的菌丝生长都有不同程度的抑制作用,不同运行年限的沼气池沼液以及不同发酵原料的沼液对草莓枯萎病菌的抑制效果均无显著差异,但不同贮液阶段的沼液对其抑菌效果影响显著。沼液的无菌滤液对草莓枯萎病菌菌丝的生长没有抑制作用;沼液及其无菌滤液对草莓枯萎病菌分生孢子的萌发均有不同程度的抑制作用,猪粪沼液及其无菌滤液对草莓枯萎病菌分生孢子萌发的抑制作用好于牛粪沼液。沼液对生产上常见的5种植物病原真菌的抑制效果有显著差别。沼液中的拮抗微生物是沼液抑菌防病的主要因子。     

两个对浓核病毒（镇江株）具感性差异的家蚕品种的血液和围食膜蛋白的比较

家蚕品种间对浓核病毒（镇江株）具有不同的感染性,为了进一步探明家蚕对浓核病毒（镇江株）感性差异的分子机制,本文运用蛋白质电泳和质谱技术比较分析了两个对家蚕浓核病毒（镇江株）感性和抗性的近等基因系家蚕品种JS和NIL的血液和围食膜组织蛋白。结果表明：这两个家蚕品种的血液和围食膜组织蛋白组成差异很小。在血液组织蛋白中发现5个差异蛋白点,其中家蚕品种JS血液中有两个差异蛋白,可能分别为酪蛋白激酶和新型组织蛋白;在NIL血液组织中发现3个差异蛋白点,其中两个可能分别为线粒体延伸因子和类丝氨酸蛋白酶,另外1个的含量极显著高于JS,为血淋巴蛋白。在围食膜蛋白中共发现4个差异蛋白点,其中JS围食膜中有1个差异蛋白可能为新型组织蛋白;其余3个蛋白点在含量上相互间存在显著差异。本研究根据组织差异蛋白的功能初步推测家蚕对浓核病毒（镇江株）感性差异与血液蛋白差异无显著相关,与围食膜蛋白差异可能有关。     

球孢白僵菌高毒菌株筛选模型的研究

研究表明,来源不同的球孢白僵菌菌株生物学性状具有多样性。相同或不同寄主分离株在毒力,产孢量对数,萌发中时,水分活率,紫外照射活率,水浴活率,生长曲线斜度等方面均具显著或极显著的差异。经逐步剔除的通径分析,得到与毒力呈显著性负相关的指标,产孢量对数和水分活经,剔除因子的贡献率仅为３．６７％。所得回归方程：ｙ＝７６．７９１９－９．４９３７ｘ１＋０．００６１２ｘ２回归显著,可作为白僵菌高毒菌株的筛选模型     

壬基酚对家蚕（Bombyx mori）生长发育的影响

采用添加环境激素壬基酚（Nonylphenol,NP）人工饲料饲养家蚕（Bombyx mori）的验方法,观察了家蚕的生长速度、生长量、变态、生命力情况。结果表明,连续取食0．500mmol·L^-1以上浓度壬基酚的饲料,家蚕幼虫和蛹的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等都明显下降,在发育后期和蜕皮、化蛹、羽化等变态时期更加明显。同时,NP在蚕体内可能有累积作用。2．000mmol·L^-1浓度的NP能使家蚕幼虫很快死亡。NP对家蚕生长发育的影响有明显的性别差异,导致家蚕的雌雄大小开差缩小,并且具有显著的浓度效应和时间效应,是环境激素效应的典型表现。     

球孢白僵菌基因组候选效应子的预测与分析

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广泛应用的生防菌株,效应子在其对寄主昆虫侵染过程中发挥着重要作用。为高通量地筛选球孢白僵菌的效应子,本研究根据球孢白僵菌全基因组信息,利用SignalP、TMHMM、TargetP和Protcomp等生物信息学软件和预测程序对球孢白僵菌中10 364个蛋白序列进行分泌蛋白预测。结果表明,共分析到940个分泌蛋白,包含了185个碳水化合物活性酶家族蛋白。其中碳水化合物结合模块(CBM)40个,碳水化合物酯酶(CE)23个,糖苷水解酶(GH)92个,糖基转移酶(GT)4个,多糖裂解酶(PL)2个,辅助功能酶(AA)24个。进一步将上述分泌蛋白与胞外酶数据库进行比对分析、半胱氨酸含量分析、多个串联重复序列分析、病原寄主互作数据库进行比对及剔除大于300个氨基酸序列的蛋白,共获得18个候选效应子,其中11个为功能未知的假定蛋白,其余为胞外蛋白、细胞壁蛋白、几丁质酶蛋白等。本研究结果为进一步探究效应子在病原菌与昆虫寄主中的互作奠定了理论基础,并为其他病原菌效应子的预测及分析提供了技术参考。     

玉米根际土球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的分离与鉴定

为明确虫生真菌在玉米根际的分布情况,通过选择性培养基对采自安徽省涡阳、萧县、蒙城3地的玉米根际土壤中的虫生真菌进行了分离,并结合形态特征及r DNA ITS序列分析对分离的菌株进行了鉴定。结果表明,从玉米根际土壤中共分离得到39个白僵菌菌株,经鉴定均为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),且不同菌株间的菌落生长速度和分生孢子产生量存在显著差异。本研究对丰富玉米地下害虫及土传病害的生物防治资源具有重要的意义。     

重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

家蚕幼虫的造血器官对重离子射线12C5+的感受性

为了研究造血器官对重离子射线的感受性，研究了碳离子射线(^12C^5 )局部照射家蚕(Bombyx mori)幼虫的造血器官后血液中的血球密度的变化。结果表明30Gy照射对造血器官的造血机能没有明显的影响，50Gy照射能引起造血器官的机能低下，50～300Gy之间没有明显的剂量依存关系；不同发育阶段幼虫的造血器官表现为随着个体的发育对重离子射线的感受性降低，雌雄间没有明显的性别差异。没有观察到由于单侧造血器官的机能障碍而引起残存在体内的另一侧造血器官的机能增强的所谓补赏生长现象。     

浓核病毒感染早期家蚕血液、中肠蛋白表达差异比较分析

为了探明在浓核病毒镇江株（BmDNV-ZJ）侵染早期,家蚕部分组织蛋白所产生的免疫抵抗性变化机制,本实验采用差异蛋白质组学技术研究分析了BmDNV-ZJ感染早期,家蚕的中肠、血液组织中特异性表达的差异蛋白。实验结果表明：在浓核病毒侵染初期,感受性家蚕的中肠组织受病毒感染而得到特异性表达的蛋白可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基抗氧化酶蛋白,前者具有调控蛋白酶活性和细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化的作用。血液组织受病毒感染诱导而产生的蛋白可能是丝裂原活化蛋白激酶和类抗氧化酶蛋白,前者具有调控细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化、消除自由基作用。由于试验中所得的差异蛋白点很少,这表明在BmDNV-ZJ感染早期,蚕体对浓核病毒的感染而产生的反应很小。蚕体可通过被侵染的中肠组织（浓核病毒感染的靶部位）P2及血液（免疫组织）共同产生一些抗氧化或调控细胞凋亡的酶蛋白等来抗击浓核病毒的侵染。     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

家蚕耐氟笥RAPD分子标记研究

在含有耐氟主效基因的家蚕品种T6和高敏感品种733新及其近等基因系NF733新中，采用200个RAPD随机引物进行扩增，获得了与家蚕耐氟性有关的两个分子标记OPD－08850和OPB－10917，用OPB－10917，分子标记在加交世代中进行检测，其结果是各回交世代耐氟性个体都出现同样的特异带，从而验证了分子标记的可靠性。     

低分子量热激蛋白Bmhsp19.9基因的表达

利用RT-PCR技术，对家蚕(Bombyx moil)低分子量热激蛋白Bmhsp19．9基因进行了定量表达分析。Bmhsp19．9在各组织中均有一定量的表达，但不同组织间的表达差异达10多倍，表达量丰富的组织是生长发育旺盛的组织，如精巢和卵巢，然后是丝腺、蛹等组织。其应激表达模式可分为3类，以其在精巢、后部丝腺和脂肪体中的强应激表达模式为主，经热刺激处理后其表达量有显著增加。经刺激诱导2h后其表达量达到最高，随后逐渐降低，在热刺激诱导12h后是未刺激的2～3倍，而此时Bmhsp19．9在脂肪体中的应激表达是其对照的10多倍。根据Bmhsp19．9在不同组织中的基本表达量、应激表达量和应激表达的持续时间各不相同，显示其与细胞分裂与分化等生命活动有一定联系。并认为其在后部丝腺、脂肪体、精巢、卵巢与血液中作用方式不一样，推测其作为分子伴侣在组织间的作用对象与作用效应也应有所差异。