单克隆抗体研制中杂交瘤细胞的冻存与复苏

为寻找出简单有效的杂交瘤细胞冻存与复苏方法,试验以３组不同组分的细胞冻存液,用３种方法冻存杂交瘤细胞。结果表明：使用Ⅲ号液采用方法Ⅲ,细胞冻存与复苏效果最佳。     

内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性

目的研究冻存对内皮生长晕细胞增殖能力和成血管能力的影响,探讨内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性。方法分离脐血中单个核细胞,采用贴壁培养法培养扩增内皮生长晕细胞,免疫组织化学染色和荧光染色法鉴定其内皮细胞特性。扩增后的细胞采用浓度为650μmol/L(体积比为50mL/L)和1040μmol/L(体积比为80mL/L)二甲基亚砜的培养基冻存至液氮中,24h后复苏并观察冻存细胞的复苏率、复苏后细胞的增殖能力和成血管能力的改变。结果采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性。细胞采用含不同浓度二甲基亚砜(50mL/L和80mL/L)的培养基冻存后,其复苏率差异无统计学意义,细胞的增殖能力在复苏后36h内50mL/L、80mL/L二甲基亚砜组均较未冻存组减弱(P<0.05),72h后三组间比较差异无统计学意义。而复苏后6h内成血管速率较未冻存组减弱(P<0.05),但30h后三组间比较差异无统计学意义。结论内皮生长晕细胞可以进行冻存和复苏。     

BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。     

伪狂犬病毒在BHK-21悬浮细胞中的增殖特性

为考察BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）工艺参数及病毒增殖过程中代谢动力学,将PRV接种于BHK-21悬浮细胞,考察接毒时细胞密度、病毒感染复数（MOI）及收毒时间对病毒效价的影响,测定培养过程中葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）和谷氨酰胺（Gln）浓度,计算病毒增殖过程中各参数代谢速率。结果显示,将MOI为0.01的PRV病毒接种BHK-21悬浮细胞,其病毒滴度在42 h达最高8.5 lgTCID₅₀/mL。代谢参数检测结果表明,BHK-21细胞在接毒36 h后细胞开始出现死亡。PRV在BHK-21悬浮细胞中的增殖特性为伪狂犬病毒的规模化培养及疫苗开发提供了技术基础。     

siRNA抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中复制的研究

选取口蹄疫病毒(FMDV)的VP1、IRES、2B、3D和L基因保守序列,设计、合成siRNA,并成功构建表达siRNA的穿梭载体,通过脂质体2000在BHK-21细胞上转染6个重组siRNA表达质粒,观察其对FMDV S72毒株复制的抑制效果.结果发现:病毒对照和空载体对照细胞死亡脱落,脂质体2000对照和细胞对照细胞状态良好; 6个siRNA转染孔细胞状态明显优于病毒对照孔,表明6个重组质粒转染后均可以显著抑制FMDV S72毒株的复制,其中靶向IRES1基因的siRNA对FMDV的复制抑制最为明显.     

水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡的初步研究

采用倒置相差显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳等技术研究水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡．形态学观察结果显示,水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的形态变化具有较典型的凋亡特征,如细胞膜内陷、核染色质凝集边聚等;琼脂糖凝胶电泳出现180-200bp整倍数的DNA梯形带．上述结果表明水泡性口炎病毒可诱导BHK-21细胞凋亡。     

氨对悬浮培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21)生长代谢的影响

【目的】研究在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)悬浮培养过程中,不同浓度氨对其生长代谢的影响。【方法】用添加0,1.8,2.5,5.5,8.0和15.0 mmol/L氨的培养基培养BHK-21细胞,每隔12 h取样1次,用细胞计数仪进行细胞计数,测定细胞活力,采用AO/EB双染色法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪2种方法检测细胞的凋亡情况,同时测定细胞培养过程中葡萄糖、氨和乳酸浓度的变化。【结果】在BHK-21细胞连续培养过程中,当氨的添加浓度低于1.8 mmol/L时,其对细胞的生长几乎不产生抑制作用,细胞活性、细胞总数与对照组差异不显著,未出现细胞聚集成团现象;当氨添加浓度达到15.0 mmol/L时,BHK-21细胞直接进入死亡期;当氨的添加浓度为2.5~8.0 mmol/L时,氨对细胞生长的抑制作用由弱变强,这种抑制作用在细胞培养至24 h开始出现。另外,随着氨添加浓度的增加,葡萄糖的消耗量减少,细胞代谢产生的乳酸和氨降低。【结论】氨对悬浮培养的BHK-21细胞的生长和代谢有显著影响。     

水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的超微结构

应用电镜技术对水泡性口炎病毒在BHK-21上的形态发生和增殖规律进行观察．结果表明：VSV能导致BHK-21细胞圆缩,胞浆严重空泡化,线粒体嵴断裂及空泡化;病毒在细胞浆内复制、增殖,在细胞膜和线粒体膜以出芽方式获得囊膜而成熟．     

猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立

目的:分析研究猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立。方法:配制甲基纤维素(MC)覆盖物、甲基纤维素(MC)覆盖物、结晶紫染色液,在进行蚀斑试验。结果:MC粘度直接影响蚀斑的形成,在粘度为1500的MC覆盖物中,JEV病毒不产生蚀斑;在粘度为4000的MC覆盖物中产生清晰的蚀斑。结论:蚀斑技术是病毒感染力测定的精确定量方法。     

静置培养BHK-21细胞生长及代谢动力学研究

为研究BHK-21细胞的生长及代谢动力学特征,试验采用低密度静置培养方法,每天测定细胞生长密度和活力,并利用多参数生化分析仪测定培养液中Gluc、Lac、Gln和NH4+的含量,计算细胞指数生长期的比代谢速率。结果表明:BHK-21细胞生长曲线呈S型,最大增殖密度为50.3×104 upf·mL-1,倍增时间为21.1h;对数生长期Gluc和Gln的比消耗速率为-3.79mg·(106 cells)-1·d-1和-9.95μmol·(106 cells)-1·d-1,Lac和NH4+的比生成速率为2.81mg·(106 cells)-1·d-1和6.30μmol·(106 cells)-1·d-1。     

猪伪狂犬病毒的增殖、纯化和鉴定

以伪狂犬病毒(PRV)活疫苗Bartha弱毒株接种于幼仓鼠肾细胞(BHK-21)使其增殖,通过PCR方法鉴定了病毒。以组织细胞半数感染剂量(TCID50)对病毒效价进行了评定,利用蔗糖密度梯度离心法纯化了病毒。结果表明,培养的病毒滴度为103.25TCID50/mL,纯化后的病毒经SDS-PAGE电泳显示,获得了较纯的蛋白条带。     

猪乙脑病毒BHK-21细胞传代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因组序列分析

为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致,均为10 977 nt,在2个病毒基因组的10 701 nt位点处均插入1个碱基G。与亲本毒株相比,2个细胞传代毒株的病毒基因组经连续传代后趋于稳定,均有10个位点发生氨基酸突变,这些突变主要集中在E蛋白区域。核苷酸序列同源性比对分析发现,与其他JEV参考毒株相比,BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60与弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性较高,分别为99.6%和95.9%,其氨基酸序列与猪源野毒分离株SH0601和HW的氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。     

猪乙脑病毒分离株CSF.XZ2D在BHK21细胞上的传代培养及E基因序列分析

为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征及其遗传基因的稳定性,将猪乙脑病毒分离株CSF.XZ-2D在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代25次后病毒E基因趋于稳定,氨基酸位点E271(E→V)和E278(V→L)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如E279和E312分别出现K→M→K和K→R→K→R的反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。     

冷冻保护剂和平衡方法对鸡胚原始生殖细胞冷冻保存效果的影响

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),应用不同的冷冻保护剂和平衡方法进行冷冻保存。PGCs解冻后用DMEM培养液进行体外培养,并采用苔盼蓝染色法鉴定复苏后PGCs的存活情况。结果表明：①从第19期或第28期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护剂下,平衡方法对PGCs的存活率有显著或极显著影响,平衡方法1的冷冻保护效果优于平衡方法2。②采用相同的平衡方法,冷冻保护剂C的冻存效果与其他保护剂之间存在显著或极显著差异,冷冻保护剂E和F对PGCs的冻存效果次之,冷冻保护剂A、B和D对PGCs的冻存效果最差。复苏后PGCs进行体外培养．其存活时间与分离后PGCs直接培养相比未出现显著缩短现象。     

不同苗龄拟南芥幼苗内源激素与可溶性糖在超低温保存过程中的响应

以超低温保存恢复生长率较高的48h拟南芥幼苗和恢复生长率较低的72h幼苗为实验材料,研究不同苗龄幼苗在玻璃化法超低温保存装载脱水过程中内源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和可溶性糖组分的变化情况。结果表明,ABA在2种幼苗的装载脱水过程中含量变化很小,IAA在48h幼苗中经过装载脱水处理含量上升了近1倍。ABA和IAA原位检测发现,ABA信号在处理过程中没有明显增强,一直处于较低水平,而IAA信号在48h幼苗装载脱水过程中则显著增强,并主要分布在子叶、根部的成熟区和伸长区。2种苗龄幼苗的可溶性糖组分总含量及部分组分在装载脱水后均有所增加,且48h幼苗可溶性糖增加量大于72h幼苗。生长素对于拟南芥幼苗超低温保存装载脱水过程给予了积极的响应,可溶性糖为48h幼苗提供了较多的保护来抵御玻璃化溶液处理产生的氧化胁迫,这些都可能是导致2种苗龄幼苗恢复生长率差异的原因。     

不同播期对晋谷21号产量及米质的影响

不同播期对晋谷 2 1号的产量及米质均有影响 ,或早或晚都会使产量减少 ,米质降低。只有适时播种 ,才会优质高产。长治地区最佳播种期为 5月下旬至 6月 6日