芥菜型油菜BjuB.KAN4基因调控类黄酮的途径

MYB类转录因子KAN4有调控植物原花青素合成的功能。为了探究芥菜型油菜中MYB转录因子KAN4对原花青素合成的调控机理,本研究以芥菜型油菜紫叶芥为实验材料,克隆了一个BjuB.KAN4基因,编码266个氨基酸,BjuB.KAN4蛋白包含一段高度保守的MYB-like DNA结合结构域,属于1R-MYB转录因子家族成员。基因表达分析表明, BjuB.KAN4在根中表达量显著高于叶和茎中, GUS组织化学染色分析试验推测,该基因可能在根茎叶的维管组织中表达。利用毛状根体系过表达BjuB.KAN4发现,类黄酮合成途径的部分关键酶基因Bju.CHS和Bju.DFR等的表达量在紫叶芥和四川黄籽的转基因根系中均显著增加,紫叶芥转基因根系中总黄酮含量为2.798 mg g~(-1),是对照组的1.3倍,四川黄籽中总黄酮含量为2.567 mg g~(-1),是对照组的1.2倍。在拟南芥中异源表达BjuB.KAN4发现,转基因植株总黄酮含量为0.237mgg~(-1),是野生型的1.5倍,原花青素含量为0.363mgg~(-1),较野生型含量下降。本研究表明,BjuB.KAN4基因参与调控芥菜型油菜类黄酮合成,为研究芸薹属植物原花青素合成的调控机理提供了参考。     

芥菜种子颜色调控基因TT8的等位变异及其地理分布分析

在芸薹属植物中TT8基因是种子颜色的调控基因。异源四倍体芥菜TT8基因有2个拷贝,分别位于A09与B08染色体上。本研究针对不同拷贝设计特异引物,对749份芥菜进行扩增、测序或酶切检测,发现BjuA09.TT8和BjuB08.TT8各有7个和6个等位变异。与野生型相比, BjuA09.TT8.a1-a5和BjuB08.TT8.b1-b4等位基因都发生了大片段插入,而BjuA09.TT8.a6出现了删除,但BjuB08.TT8.b5仅在第7外显子处有1个碱基替换。使用Repeatmasker软件对等位基因序列与甘蓝型油菜注释库进行重复序列比对,发现BjuA09.TT8.a1-a4和BjuB08.TT8.b1-b4等位基因主要含有Ⅰ类转座子,少量为Ⅱ类转座子及Helitron类转座子插入。统计还发现, BjuA09.TT8.a4-BjuB08.TT8.b5单倍型为主要的黄籽单倍型,占所分析黄籽材料的89.49%(247/276),其次为BjuA09.TT8.a4-BjuB08.TT8.b3单倍型,占6.52%。地理分布分析结果显示,中国尤其是新疆芥菜黄籽突变等位基因频率显著高于世界其他地区...     

芥菜型油菜TT1基因的克隆和SNP分析

拟南芥的TT1基因(编码含有WIP结构域的锌指蛋白)对种皮的发育和颜色的形成具有重要的调控作用。本研究利用同源克隆和RACE技术分离了芥菜型油菜TT1基因,在芥菜型油菜黄黑籽材料的种皮中进行转录水平的分析,比较了黑籽油菜与黄籽油菜基因序列的差异,并采用等位基因特异(allele-specific)PCR技术对可能存在的单核苷酸多态位点进行验证。结果表明,芥菜型油菜TT1基因的DNA序列全长为2197bp,包含1个内含子,与甘蓝型油菜TT1-1基因的DNA序列的相似性为99%,与拟南芥的TT1基因DNA序列的相似性为85%;推导的TT1蛋白序列为300氨基酸残基,理论分子量为33.97kD,等电点为6.99;TT1在所有材料的种皮中均检测到表达;比较紫叶芥、四川黄籽、NILA和NILB的TT1基因序列,共发现8个核苷酸变异位点,均在基因的外显子区域,其中紫叶芥和NILA的序列相同,四川黄籽和黒籽近等基因系NILB的序列相同。与紫叶芥相比,黒籽近等基因系NILB有8个核苷酸差异,但种皮颜色与紫叶芥一样,均为黑色,TT1基因这些位点的突变并不影响芥菜型油菜种皮的颜色。通过等位特异PCR可以区分来自四川黄籽与紫叶芥的TT1基因。     

芥菜型油菜PAP1基因的克隆与表达分析

花青素是导致芥菜型油菜叶片颜色差异的重要物质,PAP1基因是花青素合成途径中的一个关键转录调控基因.本研究利用同源克隆技术,以不同叶色芥菜型油菜为材料,根据同源性较高的白菜PAP1基因序列设计引物,克隆芥菜型油菜PAP1基因序列.芥菜型油菜PAP1基因的基因长度在1348～1669 bp,编码序列长744～753 bp,包括3个外显子和2个内含子区域.PAP1蛋白包括两个MYB结合域,分别位于第9～59和62～110氨基酸.进化分析表明芥菜型油菜PAP1基因与白菜和芜菁具有较高的同源性,与拟南芥亲缘关系较远.对比不同叶色芥菜型油菜基因序列发现,紫叶芥和红叶芥PAP1基因的编码区序列无差异,但编码的蛋白质与绿叶芥有22个氨基酸差异,定量PCR分析表明PAP1基因及其调控的下游基因如DFR、TT19等在绿叶芥油菜中表达水平较低,上述差异可能导致了芥菜型油菜叶色的差异.本研究为探究不同叶色芥菜型油菜的可能形成机制及遗传改良提供参考.     

过表达FtbZIP5提高苦荞毛状根黄酮积累及其耐盐性

bZIP转录因子不仅在植物盐胁迫网络中起着重要的作用,还可调节植物类黄酮的积累。在苦荞品种川荞1号中克隆了1个具有转录激活活性的bZIP家族基因FtbZIP5。FtbZIP5基因能被NaCl和脱落酸（ABA）诱导表达,在茎和叶中的表达高于根中。对过表达FtbZIP5基因毛状根的总黄酮含量进行检测,结果显示,总黄酮含量在过表达株系中显著高于野生株系。同时检测其类黄酮合成途径中关键酶基因的表达量,其中黄烷酮-3-羟化酶基因（F3H）的表达量较高。可推测该过表达毛状根株系中总黄酮的积累与F3H的表达有关。在NaCl（100mmol/L）胁迫下,各株系的总黄酮积累受到抑制,过表达株系的含量减少至0.63mg/g。并且,在这种压力下,F3H的表达水平仍然高于对照。植株在受到胁迫后,对照株系的过氧化氢酶（CAT）活性显著低于过表达株系。随着野生型植株受到胁迫的增强丙二醛（MDA）含量增加,但过表达株系的含量趋于稳定。以上结果表明,在过表达FtbZIP5毛状根中,总黄酮的积累可能是通过关键酶基因F3H的上调表达来调节的。并且FtbZIP5可提高苦荞毛状根耐盐性。通过解析FtbZIP5对苦荞毛状根中总黄酮积累及植株耐盐性的影响,为荞麦耐盐性和解析其耐盐机制研究奠定基础。     

芥菜型油菜毛状根诱导体系构建及TTG1基因功能初步研究

黄籽油菜具有种皮薄、出油率高等优点, 研究油菜黄籽的形成具有重要的意义。前期研究表明, TTG1 (TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)基因参与了油菜种皮颜色的形成。本研究利用发根农杆菌A4菌株诱导了芥菜型油菜四川黄籽的毛状根, 并研究了菌液浓度和外植体部位对诱导率的影响。结果表明, 菌液浓度OD值为0.8时, 诱导效率最高, 平均为71.5%; 外植体中下胚轴的发根率最高, 平均为87.3%。在四川黄籽毛状根中过表达TTG1基因, 发现原花色素合成途径中的DFR (dihydroflavonol4-reductase)、ANS (anthocyanidin synthase)和BAN (anthocyanidin reductase)基因的表达受到抑制。本研究优化了油菜毛状根的诱导体系, 为利用毛状根体系进行基因功能验证提供了新的思路和方法。     

BnABCI8影响甘蓝型油菜叶绿体发育

成熟叶绿体是高等植物光合作用的重要场所,是影响作物产量的重要器官。BnABCI8是ABC转运蛋白I亚族的成员,在甘蓝型油菜中有2个功能拷贝,分别是BnA09.ABCI8和BnC09.ABCI8,其氨基酸序列在不同物种中是非常保守的。表达模式分析发现, BnABCI8在油菜植株各个组织中均有表达,且在叶和花中表达量较高;亚细胞定位证明, BnABCI8能够定位在叶绿体中;表型鉴定发现, BnA09.ABCI8和BnC09.ABCI8的同时突变及BnA09.ABCI8的单突变均会导致黄色的子叶和褪绿的真叶,且双突变体褪绿更为严重;透射电镜结果显示,双突变体中叶绿体不能够形成正常的类囊体膜;BnABCI8的敲除导致叶绿素合成途径相关基因的表达下调,且叶片中积累了大量的Fe离子。这些结果表明,BnABCI8的突变造成叶绿体结构异常,叶绿素合成受阻,叶片中Fe离子大量积累,而Fe离子的积累又可能会引发一系列的反应如活性氧积累,细胞死亡和叶绿素降解等,最终导致了叶色突变。     

Bna-novel-miR36421调节拟南芥株型和花器官发育的功能验证

MicroRNA参与油菜种子发育、胁迫响应和胚胎发育等多种生物学过程,但其在油菜株型和花器官发育方面的报道还较少。本研究以高/低收获指数油菜中显著差异表达的Bna-novel-miR36421为对象,通过转基因植株表型、靶基因预测、表达量和双荧光素酶报告系统等解析其调控机制。Bna-novel-miR36421与植物miR167家族成员高度同源,可能为油菜新的miR167成员。Bna-novel-miR36421能靶向并抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581的表达。过表达拟南芥植株中,Bna-novel-miR36421的表达量显著上调,而上述4个靶基因的拟南芥同源基因表达量极显著下降。过表达拟南芥植株株型矮小,茎间缩短,叶片高度卷曲;花器官发育异常,雌蕊膨大,雄蕊花丝缩短,花药不开裂,花粉败育。推测Bna-novel-miR36421可能通过抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581基因表达,进而对油菜株型和花器官的发育起到重要的调控作用。研究结果对解析mi...     

甘蓝型油菜BnTT3基因的表达与eQTL定位分析

类黄酮途径中,TT3编码的4-二氢黄铜醇还原酶是参与原花色素和花青素合成的关键酶。为了明确该基因可能的上游调控网络,利用黄籽母本GH06和黑籽父本ZY821构建的遗传图谱,以Bn TT3基因在高世代重组自交系群体中随机选取的94个株系花后40 d种子的表达量作为性状,采用复合区间作图法进行e QTL分析。结果共检测到5个表达量相关的e QTL,分别位于A03、A08、A09和C01染色体,单个e QTL解释表型变异的5.22%~24.05%。A09染色体上存在2个主效e QTL,单个e QTL分别解释24.05%和16.55%的表型变异,分别位于标记KS10260~KBr B019I24.15和B055B21-5~KS30880之间,微效e QTL分布于A03、A08和C01染色体上。A09染色体上的2个主效e QTL区间(包含200 kb侧翼序列)与拟南芥、白菜、甘蓝和芸薹族近缘物种基因组同源区段具有很好的共线性关系。基因注释结果表明检测到的e QTL均为trans-QTL,2个主效e QTL区段共包含78个基因,包括MYB51、MYB52和b ZIP5转录因子,可能为Bn TT3基因的上游直接调控因子,对这些基因功能的深入分析将有助于阐明甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子调控机制,为黄籽候选基因的克隆筛选奠定基础。     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。     

芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定

锌指蛋白是一类重要的转录因子家族,参与植物基因转录调节、发育及胁迫反应等生理过程。我们前期研究发现芥菜诱导型启动子BjC-P的W-box-like-4为其真菌诱导的核心元件,本研究通过酵母单杂交技术从芥菜cDNA文库中筛选到与W-box-like-4序列特异互作的转录因子基因Bj26。生物信息学分析表明,Bj26含735 bp的开放阅读框,编码一个新的C2H2型锌指蛋白,包括2个典型的C2H2型锌指结构及2个植物特有的QALGGH氨基酸保守序列,等电点pI为9.2,分子量为26.6 kD。亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核。本氏烟瞬时表达分析表明Bj26蛋白通过与BjC-P的真菌诱导核心元件序列特异互作,激活启动子BjC-P。实时荧光定量PCR结果显示Bj26在真菌诱导下表达量明显增高。Bj26的CDS序列与拟南芥和水稻中的C2H2型锌指蛋白序列比对及进化树分析表明,Bj26与拟南芥的C2H2型蛋白同源性高于水稻。以上结果揭示Bj26蛋白可能介导BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌的调控过程。     

拟南芥种皮色素形成机制的研究进展

类黄酮为拟南芥种皮的主要成色物质,其生物合成过程受到一系列基因的影响.这些基因中,一部分为结构基因(TT4、TT5、TT6、TT7、FLS1TT3,LDOX和BAN)编码一些酶类参与到类黄酮的生物合成;一部分作为调控基因(TT1,TT2,TT8,TTG1,TTG2和TT16)编码一些酶对生物合成途径起调控作用;另外一些基因(TT12,TT19)编码与色素转运、积累相关的蛋白质。这些基因中的一种或几种发生变异就能影响到类黄酮的生物合成,从而引起拟南芥种皮色泽的变异。在此,就拟南芥种皮的色泽变异及类黄酮生物合成机理作一介绍。     

拟南芥种皮色素形成机制研究进展

类黄酮为拟南芥种皮的主要成色物质,其生物合成过程受到一系列基因的影响.这些基因中,一部分为结构基因(TT4、TT5、TT6、TT7、FLS1TT3,LDOX 和BAN)编码一些酶类参与到类黄酮的生物合成;一部分作为调控基因(TT1, TT2, TT8, TTG1, TTG2 和TT16)编码一些酶对生物合成途径起调控作用;另外一些基因（TT12, TT19）编码与色素转运、积累相关的蛋白质。这些基因中的一种或几种发生变异就能影响到类黄酮的生物合成,从而引起拟南芥种皮色泽的变异。在此,就拟南芥种皮的色泽变异及类黄酮生物合成机理作一介绍。     

芥菜型油菜黄籽性状的遗传、基因定位和起源探讨

油菜种皮颜色既是一个形态指示性状, 又与种子休眠和品质有关。以芥菜型油菜种皮颜色分离的2个BC₆F₂群体为作图群体,用微卫星(SSR)等标记进行连锁定位, 并用定位标记对22份材料进行关联分析, 通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析12份材料种皮中4-二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花色素合酶(ANS)和花色素还原酶(ANR)基因的表达, 对6份黄籽材料的种皮颜色基因等位性进行测定, 结果将芥菜型油菜控制种皮颜色的2个基因位点分别定位到A9和B3连锁群, 并找到其两侧紧密连锁标记, 发现黄籽材料种皮颜色基因位点附近0.9 cM和1.5 cM区域高度保守, 所有黑色种皮中DFR、ANS和ANR基因均表达, 所有黄色种皮中DFR和ANS均不表达,但ANR基因表达或不表达,黄籽材料的种皮颜色基因等位。根据这些结果结合前人研究, 认为芥菜型油菜种皮颜色基因是调控基因,黄籽为单一起源。     

Relationship Between Leaf Nitrogen and Photosynthetic Characteristics in Brassica juncea and B. campestris

The relationship between leaf nitrogen content (N) versus photosynthetic rate (PN) and other associated parameters was examined in Brassica juncea , cv. Pusa Bold and B campestris , cv. Pusa Kalyani. Leaf N, specific leaf weight (SLW), leaf area and PN were significantly higher in B. juncea , while the chlorophyll content was significantly lower compared to Brassica campestris. A significant positive correlation was obtained between leaf N content and photosynthetic rate in both species. Similarly, SLW was also positively related with leaf N content, Brassica juncea showed higher photosynthetic nitrogen use efficiency (PNUE) than B campestris. Leaf N and PNUE were negatively associated. This was attributed to a low investment of N in photosynthesis related reactions and/or partitioning of N towards compounds functionally unrelated to photosynthesis. This attribution is further supported by the negative relationship obtained between SLW and PNUE.