细胞永生化的研究进展

正常细胞的增殖能力有限，经过一定时间的增殖后，最终会进入一种生长抑制状态，而一些肿瘤细胞可以无限增殖。作者简要阐明了永生化细胞分子机制，并对细胞永生化方法进行了概述。     

细胞永生化技术研究进展

细胞永生化作为细胞生物学研究的热点,在细胞实验中发挥很大的作用,使目的细胞永生化,建立永生化细胞系,可以更好地开展细胞实验。细胞永生化技术的成功应用,不仅为生物实验研究提供了有力的工具,也为有效准确地诊断疾病提供了新道路。本文在细胞永生化基本机制的基础上,就细胞永生化技术方法、检测方法以及存在的问题等方面研究进展进行概述。     

hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景

人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力,是一种理想的细胞来源,在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。     

不同动物原代细胞的永生化方法及其应用

细胞永生化是一项运用多种手段人为地将不同类型的外源性永生化基因导入目的细胞,打破细胞的正常分裂周期并使其具备无限增殖能力的技术,现已被广泛应用于不同动物原代细胞中。为了探究促使细胞永生化的几种常用方法如何介导细胞永生化,不同方法之间的相关因素有何关联和区别,以及这些方法如何应用到不同动物的细胞中,本文通过对几种促使细胞永生化的作用机制、方法及其在不同动物细胞(如猪单核细胞/巨噬细胞系、牛肠上皮细胞系、牦牛瘤胃上皮细胞系、鸡前脂肪细胞系、鸡胚胎成纤维细胞系、鸭肠上皮细胞系、兔黑色素细胞系和斑节虾淋巴细胞系等)中的应用现状进行概述,发现细胞永生化主要涉及端粒与端粒酶激活、病毒基因[如人类疱疹病毒(EBV)、猴空泡病毒40(SV40)和人乳头瘤病毒(HPV)基因]的转染整合,以及运用Cre-LoxP介导的重组系统对细胞进行可回复性永生化等多个方法,且其核心都是对细胞端粒酶活性的调控。此外,不同动物细胞可通过上述多种方法实现永生,但是也有极少部分细胞受其自身性质的影响,只可选择某一特定方法。因此,对不同动物原代细胞永生化方法及其应用进行研究,不仅可为建立具备功能性的永生化细胞系提供理论依据,也...     

端粒酶与细胞永生化

端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构,由端粒DNA和端粒蛋白质组成。正常动物细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短,当缩短到一定长度时细胞将停止增殖并死亡。端粒酶可以从端粒DNA 3′OH末端延伸端粒或合成新的端粒。本文主要介绍了端粒酶的结构和功能以及在细胞永生化中的应用。     

崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

为研究崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化潜能,采用P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs进行体外成脂和成神经诱导分化。结果显示,当细胞传至P30代时,TERT-BMSCs生长旺盛;在成脂诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能观察到细胞中透明脂滴的形成,油红O染料染色后可见脂滴被染成红色;在成神经诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能形成树突样或三角形的形态,甲苯胺蓝染色后可观察到细胞中尼氏体的存在。综上提示,永生化的崂山奶山羊BMSCs在多次传代后仍具有较强的多向诱导分化能力,这为永生化MSCs的广泛应用提供了理论依据。     

东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系.     

崂山奶山羊骨髓间充质干细胞永生化细胞系的建立

为建立崂山奶山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)永生化细胞系,将已构建的pcDNA3.1-EGFPTERT转入崂山奶山羊BMSCs中,利用含G418的培养基筛选获得稳定转染的TERT-BMSCs;通过多次传代,测定其生长曲线;选取高代次TERT-BMSCs的分裂中期相的细胞,检测其染色体及核型的稳定性。结果表明,转入TERT基因的崂山奶山羊BMSCs能够稳定表达该基因,其生长曲线呈"S"形;在多次传代后,P40代细胞的核型正常率仍能达到88.24%。综上提示,转染得到的TERT-BMSCs具有良好的生长状态,其细胞生长稳定,符合永生化细胞特征,为间充质干细胞应用于组织修复及基因工程种子细胞的制备提供了理论基础。     

蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts, EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P<0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P<0.05)。细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFs...     

端粒酶在细胞永生化中的应用

细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体,而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此,将外源性端粒酶逆转录酶（TERT）基因转染至目的细胞,则可能诱导细胞发生永生化。本文从端粒、端粒酶、端粒酶在细胞永生化中的应用、端粒酶在传代细胞系中的应用、存在问题与展望等五个方面进行了综述,以期为相关研究人员提供参考。     

利用单细胞融合技术高效获得融合细胞的方法

试验以小鼠胚胎干细胞(mESC)作为细胞融合对象,用0.25%胰酶将mESC消化成单细胞,利用细胞凝集素构建一对一的单细胞对,在含有50%聚乙二醇的ES培养液中培养1 min,随后将细胞继续培养7 d,获得既表达红色荧光也表达绿色荧光的克隆即为融合成功。结果显示,单细胞融合法的克隆效率(46.25%)显著高于传统融合的效率(0.001 7%)。进一步检测融合细胞的生物学特性发现,虽然细胞形态与mESC具有很大的差异,但依然呈AP阳性,RNA水平上表达Oct4、Sox2和Nanog,具有向三胚层分化的能力等。结果表明,单细胞融合法是一种高效构建融合细胞的新途径。     

哺乳动物胚胎干细胞研究进展

胚胎性干细胞包括从动物早期胚胎的卵裂球、囊胚内细胞团细胞分离建系的胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）、从胚胎生殖嵴原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）分离建系的胚胎生殖细胞（embryonic germ cell,EGC）和来源于畸胎瘤中的胚胎性癌细胞（embryonic carcinoma cell,ECC）。ESC具有发育分化的多潜能性和无限的自我更新能力,能在体外长期培养并具有向机体各种组织细胞分化的潜能。所以,被广泛应用于胚胎发育与细胞分化调控的研究,作为修复器官与器官移植的种子细胞,并可用于转基因动物的生产。作者主要综述了干细胞的最新研究进展,ESC培养扩增诱导机制,定向分化方法。     

小鼠胚胎干细胞向骨骼肌细胞分化的研究进展

近年来,胚胎干细胞的应用越来越广泛,在体外将小鼠胚胎干细胞诱导分化为肌肉细胞,并且利用这些分化得来的肌肉细胞治疗肌肉退行性疾病,一直是胚胎干细胞研究领域的热点,而胚胎干细胞的分化机制更是其中的难点。目前,用于诱导小鼠胚胎干细胞分化为骨骼肌细胞的方法很多,但分化的效率并不是很高,所以研究胚胎干细胞向骨骼肌细胞方向分化的机制显得尤为重要。文章仅就最近几年对小鼠胚胎干细胞向骨骼肌细胞方向分化的一些方法及其机制作一综述。     

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cell into germ-like cell under effect of co-culture with testicular cell tissue

Supplements produced by mouse testicular cells (mTCs) and the interaction between cells can increase the differentiation rate of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) into the germ-like cells. We studied the differentiation rate of hUCMSCs into the germ-like cells under effect of mTCs co-culturing. Isolated hUCMSCs from postpartum human umbilical cords were cultured. Then, the expression of mesenchymal (CD73, CD90 and CD105) and haematopoietic (CD34 and CD45) markers of hUCMSCs were confirmed by flow cytometry. Then, the hUCMSCs were cultured in four distinct groups: (a) control, (b) co-culture until D0, (c) co-culture until D5 and (d) co-culture until D10, in order to differentiate into the germ-like cells. After 10 days, the expression of OCT4, VASA, Fragilis and SYCP3 genes were examined by Real-Time qPCR. The flow cytometry indicated a high expression of mesenchymal markers and a low expression of haematopoietic markers (CD73:98.6%, CD90: 99.1%, CD105: 99.5%, CD34: 4.22% and CD45: 2.54%). The expression of OCT4 decreased during the time while the expression of VASA, Fragilis and SYCP3 markers increased in the co-culture with testicular cells (p value <.05). Co-culture with mTCs may be used as an effective method to differentiate hUCMSCs into germ-like cells.     

猪源乳酸杆菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附性能

以永生化猪小肠上皮细胞ZYM—SIEC02为体外模型,通过革兰染色法、平板计数法等检测发酵乳杆菌Y091231（Lactobacillus fermentation）、乳酸乳杆菌Y091221（Lactobacillus lactis）,嗜酸乳杆菌Y224031（Lactoba-cillusacidophilus）的黏附性能及对大肠杆菌C83921、致病性沙门菌、金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制作用。结果显示,3株菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附性均较强,黏附指数平均为：Y091231（2903．25±83．33）个／100cells、Y091221（2320．37±81．02）个／100ceils、Y224031（I965．43±37．72）个／100cells,菌株之间差异不显著（P〉0．05）。黏附抑制试验结果显示,Y091231对大肠埃希菌C83921和金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑菌能力最强（（99．4±3．17）％和（98．0±2．31）％）,Y091221对沙门菌的抑菌能力最强（（97．1±2．04）％）,Y224031对大肠埃希菌C83921比对另外2种致病菌的黏附抑制能力高,但又显著低于Y091231和Y091221（P〈0．05）,表明不同种乳酸菌对致病菌的黏附抑制作用具有菌种特异性。     

胰腺干细胞的研究进展

概述了胰腺干细胞的分布、胰腺的发生、胰腺干细胞的相关标记物以及胰腺干细胞的体外分离培养、增殖、分化等领域的研究进展，并对胰腺干细胞的生物学特征、体外分离培养时遇到的困难等进行了探讨，针对所遇到的困难提出了一些改进意见。     

胚胎干细胞分化研究进展

胚胎干细胞分化的研究已成为生物学领域中的研究热点,也是生物工程、组织工程产业化的主要方向,文章对胚胎干细胞的生物学性质、分化机制、诱导途径及研究进展做一综述.     

Induced pluripotent stem cell generation from bovine somatic cells indicates unmet needs for pluripotency sustenance

Mechanisms that direct reprogramming of differentiated somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), albeit incomplete in understanding, are highly conserved across all mammalian species studied. Equally, proof of principle that iPSCs can be derived from domestic cattle has been reported in several publications. In our efforts to derive and study bovine iPSCs, we encountered inadequacy of methods to generate, sustain, and characterize these cells. Our results suggest that iPSC protocols optimized for mouse and human somatic cells do not effectively translate to bovine somatic cells, which show some refractoriness to reprogramming that also affects sustenance. Moreover, methods that enhance reprogramming efficiency in mouse and human cells had no effect on improving bovine cell reprogramming. Although use of retroviral vectors coding for bovine OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, and NANOG appeared to produce consistent iPSC‐like cells from both fibroblasts and cells from the Wharton's jelly, these colonies could not be sustained. Use of bovine genes could successfully reprogram both mouse and human cells. These findings indicated either incomplete reprogramming and/or discordant/inadequate culture conditions for bovine pluripotent stem cells. Therefore, additional studies that advance core knowledge of bovine pluripotency are necessary before any anticipated iPSC‐driven bovine technologies can be realized.     

禽类多能性干细胞研究进展

胚胎干细胞是未分化的具有增殖和自我更新能力的细胞,并且能分化成所有类型的体细胞以及生殖细胞。它们提供了早期胚胎分化的体外模型,也是基因操作的重要靶细胞。禽类多能性干细胞培养最重要的应用领域是以干细胞体外遗传修饰、鉴定为技术平台的家禽转基因技术。通过此技术对禽类基因进行遗传修饰与操作,在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产及家禽育种等方面有巨大的应用前景。但是禽类多能性干细胞培养的许多基本问题仍亟待解决,如探索其建系的培养条件、揭示其维持多能性和增殖能力的分子机制等。文章综述了禽类多能性干细胞的分离方法、体外分化能力、嵌合体形成以及基因修饰方面的研究进展及目前的研究局限。