日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因，并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽，具有疏水性，系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示，该基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物发育表达量逐渐减少，但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

日本结缕草ZjNOL基因的克隆及转录自激活检测

NYC1-like(NOL)编码的短链氧化还原酶是叶绿素b降解的必需酶。对日本结缕草(Zoysia japonica)ZjNOL基因全长克隆结果显示,该基因开放阅读框为981个核苷酸,编码327个氨基酸。生物学分析显示,ZjNOL蛋白与高粱(Sorghum bicolor)中的NOL蛋白的亲缘关系最近。利用pGBKT7载体,通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-ZjNOL酵母表达载体,通过PEG介导的转化方法,成功导入Y2HGold酵母中,自激活检测显示含有pGBKT7-ZjNOL的Y2HGold酵母细胞能够在SD/-Trp培养基上正常生长,而在SD/-Trp/AbA培养基上不能生长,也不能在含有X-α-Gal培养基显蓝色,证明ZjNOL蛋白没有自激活活性。生物信息学分析及转录自激活检测有助于深入研究ZjNOL基因功能,为延长结缕草绿期,改善结缕草坪用质量奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑日本结缕草ZjSGR基因技术研究

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28~30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P<0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。     

日本结缕草ZjERF2基因的克隆、转录激活活性、 亚细胞定位和表达分析

采用RACE的方法,克隆了日本结缕草(Zoysia japonica)ZjERF2基因(GenBank登录号为MH479420)。其开放阅读框为825 bp,编码274个氨基酸,含有一个高度保守的AP2结构域,具有典型的ERF转录因子特征。遗传进化分析表明其与黍(Panicum hallii)ERF亲缘关系最近。利用染色体步移的方法克隆ATG上游1 549 bp的启动子序列,PLACE预测其含有多个响应激素和胁迫处理的作用元件。构建了pGBKT7-ZjERF2载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S??ZjERF2?YFP载体,本生烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达结果证明ZjERF2定位于细胞核。利用实时荧光定量的方法分析了ZjERF2的表达特征,结果表明ZjERF2基因在日本结缕草不同部位及不同发育时期表达量均有差异,在成熟叶片表达量最高。此外ZjERF2表达受ET、MeJA的诱导,但受ABA、PEG和NaCl的抑制。本研究表明ZjERF2是一个参与多种信号转导途径的转录因子。     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

日本结缕草ZjADH基因的克隆及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆出1个乙醇脱氢酶基因,命名为ZjADH(GenBank登录号为KT596065)。ZjADH与甘蔗、美洲蒺藜草和沟叶结缕草等ADH基因同源性均在90%以上,进化分析表明其与沟叶结缕草亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,ZjADH定位于细胞质。实时荧光定量分析结果表明,ZjADH在日本结缕草根中表达量最高,ZjADH可响应ABA、MeJA和SA的诱导,在低温、干旱和高盐胁迫中发挥重要作用。     

日本结缕草体细胞变异表型和分子标记的研究

结缕草（Zoysia japonica）是重要的暖季型草坪草。本研究以1粒种子诱导的愈伤长期继代后的再生植株为材料,在大田中分小区种植,测量其植株表型数据,并同时利用ISSR标记对遗传变异进行分析。在形态和遗传上研究日本结缕草的体细胞变异水平和特征。结果显示,日本结缕草体细胞表型变异中匍匐茎数量和绿色期变异系数较大。10个表型性状经过主成分分析发现,重要表型指标分散,前5个主成分可以代表整体坪用表型,其中第1主成分可以代表直立茎指标,第2主成分代表匍匐茎蔓延能力和生殖枝高度。ISSR标记分析遗传多样性显示,再生植株多态性条带率83.6%,特异性条带15.1%,具有丰富的遗传多样性。本研究可为日本结缕草获得丰富优异变异提供快捷途径,并有利于根据结缕草体细胞变异特点确定育种方向,快速培育新品种。     

北京地区结缕草锈病流行规律及种质抗病性鉴定

本研究以采集自6个不同地点的162个结缕草(Zoysia japonica)植株为研究材料,于2008-2009年对参试材料在北京地区的病病原菌、病害流行规律以及植株抗病性进行了评价.结果表明,1)引起锈病的病原菌均为结缕草柄锈菌(Puccinia zoysiae);2)北京地区蛄缕草锈病病情指数整体呈单峰型发病特点,...     

不同纬度种群日本结缕草对冷胁迫的生理反应

对不同纬度分布的日本结缕草种质资源耐寒性进行了研究,低温是日本结缕草(Zoysia japonica)冬季生长的主要限制因素。在田间条件下,探讨其对冷胁迫-2℃的生理响应。结果表明,在冷胁迫下,起源于N 35°地区的草坪质量(TQ)显著低于其他纬度地区;起源高纬度地区的日本结缕草丙二醛(MDA)含量较低,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性最高,而起源低纬度地区的过氧化氢酶(CAT)活性最低;SOD和CAT活性与纬度之间呈正相关,而MDA含量与纬度呈负相关。高纬度地区日本结缕草游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量显著高于低纬度地区日本结缕草,并与纬度呈正相关。     

沟叶结缕草八氢番茄红素基因ZmPSY的克隆、亚细胞定位及表达分析

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是生物类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶。本实验从沟叶结缕草中克隆得到ZmPSY基因(Genbank登录号为:KY264128)。该基因开放阅读框为1230 bp,编码409个氨基酸残基。亚细胞定位结果显示,ZmPSY定位于叶绿体中。实时荧光定量分析表明,ZmPSY基因在沟叶结缕草幼嫩的叶片中表达量最高。ZmPSY可受外施激素脱落酸(ABA)的诱导,但受外施激素水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制。本实验为深入研究沟叶结缕草八氢番茄红素合成酶基因的功能奠定了基础。     

日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶（Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,目前有关日本结缕草（Zoysia japonica）PPH基因的上游调控机制仍不是十分清楚,筛选日本结缕草ZjPPH1基因上游转录因子可以为延长绿期延缓衰老提供理论依据。本研究利用Clontech的SMRT cDNA合成技术构建一个日本结缕草衰老叶片的高质量全长cDNA文库,其滴度为2.0×10⁶ cfu·mL^-1,插入片段平均长度大于1 kb,cDNA片段插入重组率为100%。该文库的完整性较高,可涵盖绝大多数基因信息,为酵母单杂交筛选奠定了基础。利用酵母单杂交技术,筛选到可与ZjPPH1基因启动子片段结合的候选菌落42个,并对20个候选基因进行测序和生物信息学分析,初步筛选到6个参与细胞生长和衰老过程的重要候选基因,为进一步探索ZjPPH1基因在日本结缕草衰老和叶绿素降解中的上游调控机制提供了理论支撑。     

日本结缕草抗寒相关性状的QTL分析

为寻找与结缕草(Zoysia japonica steud.)抗寒性状相关的数量性状位点(QTLs),利用生态条件具明显差异的2个日本结缕草品系室兰(Zoysia japonsic cv. Muroran)和俵山北(Zoysia japonsic cv. Tawarayama Kita)及其假测交产生的F₁代86个个体为材料,研究其在人工低温胁迫条件下叶片的半致死温度(LT₅₀)及可溶性糖、可溶性蛋白含量及过氧化物歧化酶(SOD)活性的变化,并以447个SSR标记构建的日本结缕草遗传连锁图谱为基础,对抗寒相关的性状可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性进行了QTL定位分析。结果表明:F₁群体的可溶性蛋白含量与叶片LT₅₀呈显著负相关(P<0.05),可溶性糖含量及SOD活性与叶片LT₅₀呈极显著负相关(P<0.01)。分别定位到与叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD活性相关的QTL各1个,分布于3个连锁群上,QTL的LOD值介于2.19~2.42之间,单个QTL可解释性状表型变异的范围在13.3%~13.8%。     

结缕草ZjSGR基因在离体模拟逆境胁迫环境下的功能

结缕草（Zoysia japonica Steud.L）是禾本科多年生草本植物，适用于运动场草坪建植等。但结缕草在北方生长绿期较短，制约了其大面积的应用，因此培育绿期长、抗性好的结缕草品种成为重要育种目标。而SGR（STAY-GREEN）滞绿基因的发现为改善结缕草持绿性提供了便利。本研究通过对野生植株与结缕草Zjsgr突变株系的叶绿素含量、MDA （Malondialdehyde，MDA）含量、可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性等指标进行检测，探究野生植株与突变植株在离体处理模拟的逆境胁迫下各指标之间的变化。结果表明：突变植株与野生植株相比，在逆境胁迫下叶绿素含量下降幅度更小；逆境胁迫下，突变植株的MDA含量和可溶性蛋白含量更低；在非胁迫环境下，突变植株部分抗氧化酶活性更高。总体来看Zjsgr突变植株在离体处理下具有较好的持绿性，较强的抗氧化能力。综上所述，ZjSGR基因可能与植物抗逆性有关，为全面研究ZjSGR基因的功能奠定了基础，对选育结缕草滞绿、抗逆品种具有重要作用。     

7个暖季型草坪草品种对低温胁迫的抗性差异研究

本研究以假俭草（Eremochloa ophiuroides ）、海滨雀稗（Paspalum vaginatum）、结缕草（Zoysia japonica）、‘天堂草419’（Cynodon dactylon ‘Tiffgreen 419’）和普通狗牙根（Cynodon dactylon）等5种暖季型草坪草种的7个品种为供试材料,研究了在25℃（CK）和15℃,10℃,5℃3个低温胁迫下的生理生化特征。结果表明：7个品种在低温胁迫下坪用性状指标不同程度下降,随胁迫温度的降低,草坪草叶片中丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖含量和相对电导率上升,叶绿素含量快速减少;海滨雀稗在5℃低温胁迫3 d枯黄,沟叶结缕草在5 d枯黄。综合7种暖季型草坪草品种的生长表现与生理指标,其抗寒性由强到弱依次为普通狗牙根 > ‘天堂草419’ > 中国假俭草 >‘兰引三号’结缕草 > 中华结缕草 > 沟叶结缕草 > 海滨雀稗。     

结缕草品种抗寒性和抗寒机理研究

通过低温胁迫处理兰引3号结缕草(Zoysia japonica Steud. cv. Lanyin No.3)、青岛结缕草(Zoysia japonica Steud. cv. Qingdao)和交大1号结缕草(Zoysia japonica Steud. cv. Jiaoda No.1),分别测定27~-17℃3个品种的叶片、茎电解质渗透率(EL)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性并进行地下茎恢复生长试验,得出生理指标的动态变化规律。结果表明:低温胁迫下,兰引3号结缕草抗寒性最强,EL、MDA和SOD三者显著相关。该研究可为结缕草的推广和应用提供重要理论依据。     

结缕草属杂交后代抗寒性评价

以结缕草(Zoysia Willd.)杂交后代为材料,以Z014(马尼拉)、Z129(青岛结缕草)及Z077(“兰引3号”结缕草)为对照,以电解质外渗法和地下茎恢复性生长评价其抗寒性,分析抗寒性、枯萎期及青绿期的回归关系。结果表明:叶片电解质外渗率半致死温度(LT₅₀)的变化范围为-5.78~-8.26℃,其中22-2、40-2和40-8的半致死温度均低于对照;叶片半致死温度由低到高,即抗寒性由强到弱依次为22-2>40-2>40-8>Z077>Z129>Z014>40-5>31-3>18-1>18-4>37-1>22-3;地下茎恢复生长试验结果表明,杂交后代在-6℃时全部致死,在-2℃处理后均可以恢复生长,恢复生长的百分率变异较大(14.7%~100%),其中31-3与40-2超过Z014与Z077,22-2超过Z077;供试材料间叶片和地下茎抗寒性的测定结果一致;回归分析结果表明,叶片的半致死温度、青绿期及枯萎期相关不显著。     

沟叶结缕草蛋白质二硫键异构酶(ZmPDIs)基因家族耐盐功能分析

蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）及其类蛋白,是硫氧还蛋白超家族的重要成员,具有分子伴侣活性及钙离子结合位点,负责催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构。本研究从沟叶结缕草基因组中鉴定获得了5个蛋白质二硫键异构酶（ZmPDIs）基因,对其进行了系统进化与基因结构的生物信息学分析,利用同源基因缺失酵母突变体对其耐盐功能进行了初步分析。荧光定量RT-PCR结果表明5个ZmPDIs基因的表达均受到盐胁迫的诱导。这些结果为进一步研究ZmPDIs的耐盐生理功能及分子机制提供参重要参考。     

中国主要地区结缕草属植物种质资源抗旱性变异分析

抗旱性是植物重要的节水性状,探索结缕草属（Zoysia Willd.）植物种质资源的抗旱性变异可为该属植物抗旱育种和抗旱机理研究奠定重要基础。以目前国内园林绿化中广泛应用的青岛结缕草（Z. japonica‘Qingdao’）和沟叶结缕草（Z. matrella）为对照,采用表征永久萎蔫系数法对中国结缕草属植物5种、2变种共31份种质的抗旱性变异进行研究。结果表明：中国结缕草属植物的表征永久萎蔫系数存在丰富的变异,其变异范围为4.34%～9.28%,变异系数为24.41%;且植物抗旱性存在极显著差异,表征永久萎蔫系数显著低于青岛结缕草的有14份种质,显著低于沟叶结缕草的有7份。不同种植物抗旱性也不同,各种及变种的表征永久萎蔫系数依次为：日本结缕草（Z. japonica）<细叶结缕草（Z.tenuifolia）<沟叶结缕草<青结缕草（Z. japonica var. pollida）<中华结缕草（Z. sinica）<长花结缕草（Z. sinica var. nipponica）<大穗结缕草（Z. macrostachya）;4个种的变异系数依次为：细叶结缕草<中华结缕草<沟叶结缕草<日本结缕草。抗旱性在日本结缕草和中华结缕草种内存在极显著差异;中国结缕草属植物、日本结缕草和中华结缕草的抗旱性与地理分布均不具有明显相关性。