肝片吸虫免疫显性抗原基因的筛选及鉴定

为筛选出特异的肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断靶标,利用肝片吸虫阳性血清筛选肝片吸虫cDNA表达文库,获得肝片吸虫特异性抗原基因,采用RT-PCR技术扩增目的基因,连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化入感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白表达情况进行鉴定。结果显示:经筛选获得了17个肝片吸虫免疫显性抗原基因,其中假定蛋白Fh010935为肝片吸虫特异性抗原基因;扩增得到的Fh010935核苷酸序列大小为144 bp,编码48个氨基酸,A+T含量为55.56%;Fh010935蛋白由1个α-螺旋,2个β-折叠和3个β-转角构成,具有3个抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性;重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约24 ku,可以被肝片吸虫感染阳性血清特异性识别,具有较好的反应原性。提示:假定蛋白Fh010935可作为肝片吸虫病诊断候选抗原,为疾病诊断制剂的开发提供前期基础。     

肝片吸虫抗原的研究

肝片吸虫病是人畜共患寄生虫病之一,常以慢性亚临床的形式出现,较难从临床症状上作出早期诊断。传统的粪便检查法在虫体移行的2一4个月期间查不到虫卵,必须待虫体在宿主肝、胆管中发育成熟后,才有虫卵随粪便排出体外,即使在显症期也只有50％的病人可从粪便或十二指肠引流物中找到虫卵,家畜的虫卵检出率更低。因此,早期确证就需要免疫学诊断。免疫学诊断中,由于肝片吸虫抗原成分复杂,包括有14种多糖,10种脂蛋白,6种糖蛋白,它们在宿主体内各自产生免疫反应,势必分散功能性抗原的作用’‘’。所以,选择合适的抗原是肝片吸虫病免…     

肝片吸虫分泌排泄抗原及主要多肽对动物模型的免疫保护

体外培养肝片中吸虫成虫,制备收集其分泌排泄抗原（ＥＳ抗原）。通过制备性ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离纯化分泌排泄抗原中免疫印迹信号最强的两种多肽－１８．６ＫＤ和１７．２ＫＤ多肽。用分泌排泄抗原和两种多肽分别对动物模型进行免疫保护性试验。大鼠和家兔经抗原免疫后,口服攻击新鲜活性肝片吸虫囊蚴,攻击感染的第６０天解剖动物,统计活虫数并计算减虫率。试验结果显示：肝片吸虫的ＥＳ抗原和１８．６ＫＤ及１７．２     

胰吸虫与肝片形吸虫成虫抗原的酶联免疫印迹分析

用SDS-PAGE和酶联免疫印迹试验(ELIB)分析胰吸虫成虫(EP）及其与肝片形吸虫成虫(Fh)交叉／共同抗原的分子量和免疫活性。SDS-PAGE结果显示，胰吸虫和肝片形吸虫成虫抗原的多肽均达30余条，EP抗原分子量在123kd以下，主带4条；Fb抗原分子量在83kd以下，主带4条；两者具相同分子量的多肽6条。ELIB结果显示，抗原与同源抗血清呈现颜色较深、数量较多的区带，而与异源抗血清则呈现数量不等的交叉／共同反应区带，表明两虫之间存在交叉／共同抗原性多肽。     

牦牛肝片吸虫分泌排泄抗原的生化特性和免疫印迹分析

肝片吸虫的分泌排泄抗原（ＥＳ抗原）在诊断及诱导机体产生抗体方面具有重要作用。本文对寄生于牦牛的肝片吸虫ＥＳ抗原的蛋白质组成及其生化特性进行了分析。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳显示ＥＳ抗原共有９条带,主要由１２－２６ＫＤ的小分子量蛋白质组成;糖蛋白及脂蛋白染色后发现ＥＳ抗原中糖蛋白极少,而含有较多的脂蛋白;等电聚焦电泳结果显示ＥＳ抗原有２２条带,几乎全部是酸性蛋白,ｐＩ主要集中在４．２５～５．２５范围内;双向电泳共检出３０个多肽,主要分布在ｐＩ４．５～７．０之间;免疫印迹分析结果表明：ＥＳ抗原中分子量为１６．２ＫＤ～１８．６ＫＤ的蛋白质是主要的抗原成分,其中１７．２ＫＤ多肽具有最强的免疫原性。     

片形吸虫分泌排泄抗原和虫体抗原的分析

用牛源肝片吸虫（南京）、牛源大片吸虫（广西）和羊源肝片吸虫（实验感染）制备可溶性虫体抗原（BA）和和分泌排泄抗原（ES），以SDS－PAGE电泳分析比较，结果显示，3株虫体可溶性虫体抗原至少有20条以上的主要蛋白条带，分子量集中于10－90KD之间，它们之间无显著差异，而3株分泌排泄抗原蛋白成分较简单，明显可分的条带不超过5条，分子量集中于10－30KD之间，且均拥有26－28KD的蛋白成分，提示该蛋白应为片形吸虫ES抗原的主要免疫成分。     

大鼠感染肝片吸虫后某些免疫介质变化的研究

３０只成年大鼠随机分成感染组和对照组，感染组每只习一次口服２５个肝片吸虫囊蚴。通过整体和肝脏离体灌流的方法研究大鼠在感染肝片吸虫后机体免疫功能的变化以及一些免疫介质在抗肝片吸虫和诱导肝损伤中的作用。结果发现，大鼠抗肝片吸虫ＥＳ抗原特异抗体（ＩgＧ）从感染后第２周开始显著升高，第８周回落到与对照组相当水平。感染组大鼠血浆 和肝组织匀浆中ＮＯ水平虽高于对照组，但差异不显著（P〈０．０５），而离体肝脏灌流     

肝片吸虫的特性及肝片吸虫病的预防与治疗

肝片吸虫病是一种寄生虫病,主要是由肝片吸虫寄生在牛羊等反刍动物肝脏、胆管内引发的。该病的感染率高,发病率为10%~100%,能引起急性、慢性的肝炎或胆管炎,并可继发全身的中毒和营养障碍,不仅影响羊的生长发育,而且导致羊的生产性能显著降低,病情严重者能够引起羊只的大批死亡,危害非常严重。在充分查阅资料和调研的基础上,阐明肝片吸虫的发育特征、对羊致病的危害性与规律,并提出预防和治疗的措施,以供养羊户参考。     

国产三氯苯咪唑驱除山羊肝片形吸虫效果试验

以国产三氯苯咪唑对自然感染肝片形吸虫的山羊进行了驱虫试验，并以硝氯酚为药物对照。结果表明，三氯本咪唑5mg/kg体重的剂量对肝片形吸虫成虫和童虫的驱虫率分别为99.3%和92.9%，驱净率为75％；三氯苯咪唑10mg/kg体重的剂量对肝片形吸虫成虫和童虫的驱虫率均为100％，驱净率为100％；硝氯酚5mg/kg体重剂量对肝片形吸虫成虫驱虫率为100％，但对童虫的仅为74.3%，而驱净率仅为60％。在整个试验期间试验羊均无不良反应。     

肝片吸虫对奶牛生理生化水平的影响及分析

[目的]试验选择济南地区3个奶牛场中5头感染肝片吸虫的奶牛和5头健康奶牛为试验动物,对感染肝片吸虫的奶牛生理生化指标进行了探讨。[方法]通过对奶牛体温、呼吸、心率和血液中红细胞、白细胞、血红蛋白和红细胞压积的测定来观察奶牛机体生理指标的影响;通过对血清中血糖、谷丙转氨酶和总胆红素的测定来观察肝片吸虫对奶牛血液生化指标的影响。[结果]感染肝片吸虫的奶牛体温、呼吸和心跳与对照组相比显著升高,血液红细胞总数、红细胞压积、血红蛋白降低,白细胞总数升高;血清中血糖、谷丙转氨酶和总胆红素的含量与健康组相比显著升高。[结论]肝片吸虫对奶牛的生理和生化水平都有一定程度的影响。     

三氯苯咪唑混悬剂对牦牛肝片吸虫的驱虫试验

应用三氯苯咪唑混悬剂,选择自然感染肝片吸虫的牦牛60头进行了驱虫试验。结果表明:①三氯苯咪唑混悬剂5mg/kg体重剂量对肝片吸虫的虫卵转阴率、减少率分别为83.3%、90.0%,对成虫的驱净率和驱虫率分别为91.7%、93.8%,对童虫的驱净率和驱虫率分别为83.3%、90.1%;10、15mg/kg剂量对肝片吸虫虫卵转阴率、减少率及成虫、童虫的驱净率和驱虫率均达100%;②三氯苯咪唑混悬剂10mg/kg剂量与同剂量三氯苯咪唑片剂的驱虫效果无明显差异;③三氯苯咪唑混悬剂3个剂量组试验牛未见异常反应。试验证明三氯苯咪唑混悬剂10、15mg/kg剂量驱除牦牛肝片吸虫高效安全,临床使用以10mg/kg剂量为宜。     

绵羊肝片吸虫谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与序列分析

本研究扩增肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因,并进行同源性分析。根据GenBank发表的部分Fh GST基因序列设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出Fh GST基因完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析。获得Fh GST基因全长682 bp,编码218个氨基酸,与澳大利亚分离的肝片吸虫GST同源性较高,与大片吸虫和卫氏并殖吸虫的GST也有较高的同源性。不同虫株GST基因具有较高的同源性,因此Fh GST蛋白不适合用作诊断抗原,但由于其存在交叉反应,GST基因作为分子疫苗的候选基因具有重要意义。肝片吸虫GST基因的克隆,为进一步研究GST蛋白的功能和作用奠定了基础。     

实验肝片吸虫感染对大鼠机体自由基代谢影响的研究

通过大鼠感染肝片吸虫复制感染模型 ,研究肝片吸虫感染后血清抗氧化功能的变化。 60只大鼠随机分成感染组和对照组 ,每组 30只。感染组大鼠一次口服 2 5个囊蚴 ,对照组不感染。于感染前 (0周 )和感染后 (1 ,3,5,7,9周 )采集血样 ,检测感染后谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (CAT)活性和丙二醛 (MDA)含量的变化。结果表明大鼠感染肝片吸虫后 ,感染组血清中GSH Px先升高后下降 ,SOD活性无明显变化 ,CAT活性在感染后下降 ,MDA含量在前 5周变化不明显 ;说明自由基参与了肝片吸虫病的发病过程     

实验感染肝片吸虫山羊的病理生理学——Ⅲ.细胞因子水平的变化

试验选择6只健康白山羊（经粪便学检查和Dot-ELISA检测，确认无肝片吸虫感染）随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，其中Ⅰ、Ⅱ组山羊每只分别1次口服接种200、500个肝片吸虫囊蚴，Ⅲ组作为不感染对照组，每周颈静脉采血1次，连续11周，检测肝片吸虫感染后山羊血清中IL-2、TNF-α水平的变化和外周血淋巴细胞分泌IL-2的能力。结果表明，山羊试验感染肝片吸虫后，Ⅰ组山羊血清IL-2水平在感染后有所下降，而Ⅱ组山羊血清IL-2水平在感染后有所升高；感染不同剂量肝片吸虫的山羊血清TNF-α水平和淋巴细胞IL-2分泌水平均有不同程度的升高，在感染后第1周淋巴细胞就有反应，并且对非特异性刺激原和特异性刺激原的应答都有显著升高。这一结果提示，TNF-α可能参与肝片吸虫对肝的损伤过程，肝片吸虫感染剂量对宿主的IL-2含量影响较大，同时IL-2在宿主防御免疫中有重要作用。     

Closantel缓释剂驱除山羊实验感染肝片吸虫的效果

选用 5只实验感染肝片吸虫山羊进行 Closantel(氯氰碘柳胺 )缓释剂驱虫试验。试验用山羊每只一次性口服肝片吸虫囊蚴 15 0个 ,感染后第 15周随机将山羊分成对照组 (n=2 )和驱虫组 (n=3) ,驱虫组每只羊口服 2丸 Closantel缓释剂 (含 15 .5 % Closantel,每丸 7.6 g) ,每周定时采集颈静脉血和进行粪便检查 ,每月称重 ,试验结束时剖检测量肝重和计数肝内虫体数 ,以驱虫前后山羊的红细胞、白细胞、嗜酸性粒细胞、血清抗体和一氧化氮的变化、体重变化、剖检时肝重 /体重之比、虫卵的变化以及虫体减少率作为衡量驱虫效果的指标。结果表明 ,投药后嗜酸性粒细胞在第 1、2、3周与对照组相比有显著下降 ,其他各项指标与对照组相比虽有一定差异但不显著。虫体减少率为 4 1.2 2 %。提示Closantel缓释剂对驱除实验感染肝片吸虫有一定效果 ,在虫体感染前投药会起到预防作用。