木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

木薯查尔酮合酶MeCHS基因家族特征与表达分析

查尔酮合酶（chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径的第一个限速酶，在植物花色形成、生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要作用。为明确木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯块根采后腐烂（PPD）中的表达，本研究利用生物信息学方法对木薯MeCHS基因家族成员进行理化性质、蛋白质结构等分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeCHS基因在不同品种、不同组织及块根PPD过程中的表达情况，同时克隆并构建3个高表达的MeCHS基因的亚细胞定位载体并进行烟草瞬时转化以确定其定位。在木薯基因组中共鉴定出5个MeCHS基因家族成员，蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。qRT-PCR分析发现：MeCHS基因表达具有明显的组织特异性，在茎中表达水平最高；在木薯中主要表达的MeCHS基因为MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3，且3个基因随着SC8块根贮藏时间的延长表达量逐步升高。将成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因经农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞，显微观察表明3个基因均定位于细胞质，与预测结果相符。该研究结果可为进一步揭示木薯MeCHS基因家族的功...     

生长素反应因子ZmARF1的表达分析及互作网络探究

以抗旱型玉米自交系郑36和弱抗旱型玉米自交系B73为试验材料,利用克隆、qRT-PCR、亚细胞定位、互作蛋白预测等手段验证ZmARF1(GRMZM2G702026)对干旱胁迫的响应模式及初步探究ZmARF1基因的互作网络。克隆及测序分析表明,该基因含有1个2 034 bp的开放阅读框,翻译677个氨基酸。蛋白分析表明,该蛋白无跨膜域,属于高亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞核。潜在磷酸化位点分析显示,ZmARF1蛋白含有潜在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点数目分别为39、16、6个。复合进化树、功能域和保守motif分析表明,该基因蛋白与其他物种同源性较高,说明不同物种该基因在功能上较保守。ZmARF1属于组成型表达基因,受干旱胁迫的正向诱导,且郑36基因表达量上升幅度大于B73。预测的互作功能蛋白主要通过调节激素应答基因的表达、参与激素介导的信号等途径,来调控植物对逆境的胁迫应答和生长发育等过程。     

菠萝COL基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

COL(CONSTANS Like)基因不仅响应光周期调控,还参与植物器官的发育及非生物胁迫的响应.本研究克隆了4个菠萝COL(AcCOL)同源基因,预测其蛋白的结构理化性质和启动子顺式作用元件,并探究AcCOL基因在乙烯利处理后的时空表达模式.结果表明:AcCOL1、AcCOL2基因分别编码387、243个氨基酸,都...     

MeJA和ET对巴西橡胶树胶乳HbGSK1基因表达的影响

GSK3蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。GSK3是否在橡胶树JA和ET信号途径起作用尚不清楚。qPCR分析结果表明，机械伤害、MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树JA和ET植物激素信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达的调节具有协同作用。     

香蕉MuMADS2基因表达产物的亚细胞定位

对已获得的香蕉MuMADS2基因进行生物信息学和芯片分析表明,该基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核中,是乙烯上游的调控因子,参与调控香蕉果实的成熟过程。为进一步研究该基因功能,构建香蕉MuMADS2基因与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因融合的植物表达载体pCAMBIA1302-MuMADS2,再利用基因枪转化法将其转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位观察。结果表明:该基因表达产物定位于细胞核中,符合转录因子特性。     

木薯糖转运蛋白MeSWEET18的克隆与功能分析

木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带亚热带地区重要的粮食作物。而SWEET家族基因在植物运输糖类、生殖和发育、植物逆境、与病原体互作等方面发挥着重要作用。为了明确SWEET家族基因在木薯生长发育过程中的功能，本研究以木薯华南9号（SC9）作为实验材料，克隆糖转运蛋白基因MeSWEET18并进行生物信息学分析，通过酵母实验验证其糖转运能力；采用qRT-PCR分析该基因在木薯不同器官及不同发育时期的表达情况以及在非生物胁迫下的表达趋势。结果表明：MeSWEET18基因开放阅读框为714 bp，编码237个氨基酸，蛋白分子质量为25.94 kDa，理论等电点为6.57，不稳定系数为37.50，属于稳定类蛋白。MeSWEET18蛋白N端含有保守结构域MtN3＿slv,C端含有PQ-loop super family保守结构域，且具有7个跨膜结构域，是典型的膜蛋白。ProtScale预测表明MeSWEET18蛋白属于亲水性蛋白。系统进化树分析发现MeSWEET18属于CladeⅣ亚类，与AtSWEET16、AtSWEET17亲缘关系最近；氨基酸序列同源分析显示，MeSW...     

亚洲棉CBL基因家族鉴定及生物信息学分析

为了探究CBL(钙调磷酸酶B亚基蛋白)基因参与棉花非生物胁迫响应.利用生物信息学的方法对亚洲棉CBL家族成员进行鉴定,并对其成员的理化性质、进化关系、基因结构、蛋白结构、染色体定位、顺式作用元件进行分析.结果表明,在亚洲棉中获得20个CBL基因,该基因成员蛋白的理化性质差异不大,大多数CBL基因成员的等电点为4～5.5...     

茶树MADS-box转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

本研究基于茶树转录组数据库,以茶树龙井43为试验材料,通过RT-PCR方法从该茶树的cDNA中克隆得到1个CsMADS1基因。序列分析表明:茶树CsMADS1基因开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸,是典型的植物MADS-box家族转录因子。序列多重比对显示,该序列与多个相关物种的MADS-box序列一致性为65.65%,含有高度保守的MADS结构域和半保守的K结构域。氨基酸理化性质、亲疏水性、亚细胞定位预测、无序化分析,以及二级和三级结构分析显示,CsMADS1转录因子是亲水性蛋白,可能定位于细胞核中,无序化程度明显,以α-螺旋结构为主,并与人MEF2蛋白具有相似的三级结构。利用实时荧光定量PCR方法分析了茶树龙井43中CsMADS1基因在非生物胁迫下的表达。结果表明,茶树中CsMADS1基因对高温、低温、干旱和高盐等不同非生物胁迫有响应,且表达存在差异。     

龙眼DlTRF2-like的克隆及表达模式分析

以龙眼成熟叶片为材料,克隆龙眼MYB-related基因家族TRF2-like基因,命名为DlTRF2-like,并对其进行生物信息学和表达模式分析。DlTRF2-like基因属于MYB-related家族的TRF-like亚家族,ORF长度是909 bp,编码含有302个氨基酸残基的蛋白,预测该基因定位于细胞核,同源基因进化分析表明龙眼DlTRF2-like与阿月浑子PvTRF2-like亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR检测DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龙眼不同组织及乙烯利和多效唑处理后不同时间的相对表达量。结果表明：DlTRF2-like在龙眼不同组织中均有表达,在花芽中表达量最高;乙烯利和多效唑处理后,DlTRF2-like基因的表达量明显高于对照,推测DlTRF2-like响应乙烯利和多效唑信号促进龙眼成花。     

菠萝SVP基因对乙烯利刺激的响应

SVP（short vegetative phase）是一类开花抑制基因,通过调节开花相关基因的表达,影响植物从营养生长阶段向生殖生长阶段的转变进程。根据公布的菠萝基因组信息,从‘台农4号’菠萝中克隆到2个AcSVP基因AcSVP1和AcSVP2。结果表明：AcSVP1和AcSVP2分别编码225和230个氨基酸,均含有MADS-box、K-box保守结构域,二者所编码蛋白均属MADS-box基因家族成员。定量PCR分析结果显示,2个AcSVP基因在菠萝茎尖、茎基和叶中均有不同程度的表达,乙烯利处理后主要表现为下调。乙烯利处理8 h内,AcSVP1在茎尖、叶中的表达显著下调,但在茎基组织中呈现先下调后上升的趋势;乙烯利处理后8 h,茎基组织中AcSVP1的相对表达量略高于对照。与AcSVP1不同,乙烯利处理8 h内AcSVP2在茎尖、茎基、叶3种组织中均明显下调;乙烯利处理后8 h,AcSVP2在茎尖、茎基、叶组织中的相对表达量只有对照的8%、44%和33%。SVP是目前已知的最重要的一类开花抑制基因,AcSVP在响应乙烯利的过程中表达显著下调,表明其在乙烯利诱导菠萝成花过程中可能发挥重要作用。     

木薯细菌性萎蔫病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇分子分析

细菌性萎蔫病是世界范围内木薯种植中的重要病害,也是中国木薯种植中为害最严重的病害。前期研究发现铜基杀菌剂对国内木薯细菌性萎蔫病防效欠佳,随即开展了病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇的分子分析工作。评价了42个不同来源病原菌菌株对硫酸铜的抗性,发现其抑菌最低有效浓度均在1.35~1.75 mmol/L之间。通过和已报道黄单胞菌类抗铜相关基因的比对分析,发现来自广西的菌株GX11携带有cop TAB和Xme RSA2个抗铜基因簇。对来自南美州、非洲和亚洲67个菌株的基因组序列分析发现绝大多数菌株均带有这2个基因簇,聚类分析发现相关基因在菌株之间具高度的同源性。     

木薯MeNAC29、MeNAC30基因的克隆及表达分析

NAC(NAM/ATAF/CUC)基因家族是广泛分布于陆生植物的一类转录因子,在植物生长发育和胁迫应答的调控中发挥重要作用。本文对该基因家族在木薯抗细菌性萎蔫病方面的作用机制进行了初步研究。采用RT-PCR技术从木薯cDNA中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因,并采用qRT-PCR技术对抗、感种质受木薯萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis,Xam)侵染后2个基因的表达变化进行了定量分析。结果表明,2个基因均含有3个外显子和2个内含子,且均有保守的NAM结构域。MeNAC29基因的开放阅读框全长888 nt,编码295 aa。MeNAC30基因的开放阅读框全长870 nt,编码289 aa。接种木薯萎蔫病菌后,抗病种质中MeNAC29和MeNAC30基因的表达量显著高于感病品种,表明这2个基因参与了木薯对细菌性萎蔫病菌的抗性反应。     

荔枝果皮MADS-box基因的克隆与初步表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术从‘糯米糍’荔枝果皮中克隆到了1个1 208 bp的MADS-box基因，命名为LcMADS9。该基因包含1个738 bp的完整的开放阅读框, 编码245个氨基酸，具有典型的MADS-box基因结构，其编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有较高的一致性，其中与欧洲白桦（Betula pendula）的同源性高达80％。系统发育树分析结果表明，LcMADS9基因属于MADS-box基因家族中AP1/SQUA-like亚家族。实时荧光定量PCR分析结果表明，该基因在叶片、果皮和花中均有表达，而在根、茎和果肉中几乎没有表达。     

木薯MeCML24与MeSAUR1互作调控MeAGPS1a表达的功能验证

木薯是华南地区重要的经济作物,其块根富含淀粉。解析木薯块根淀粉合成调控机理将有助于木薯高产、高淀粉分子改良。AGPase由大亚基和小亚基构成,催化1-磷酸葡萄糖和ATP形成腺苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,其中腺苷二磷酸葡萄糖为淀粉生物合成的底物。AGPase酶是植物淀粉合成的限速酶,提高AGPase酶活性,有利于作物淀粉的积累及产量的提高。木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是AGPase的催化中心,前期研究表明生长素响应因子MeSAUR1作为转录因子正调控MeAGPS1a基因表达,酵母双杂交筛选木薯cDNA文库显示钙调素类似蛋白（CaM-like, CML）成员MeCML24为MeSAUR1的候选互作蛋白。为了确定MeCML24和MeSAUR1的互作关系,本研究从‘SC8’木薯品种基因组克隆了MeCML24基因,该基因的CDS区长度为492 bp,编码163个氨基酸。MeCML24蛋白的理化性质及二级结构分析显示,该蛋白理论等电点pI值4.38,属于亲水性蛋白,α-螺旋占52.76%,无规则卷曲占30.06%,β-转角结构占11.04%。构建酵母双杂交载体BD-MeCML24,自激活实验表...     

黑麦MIKC型MADS-box家族基因的鉴定和表达分析

MIKC是MADS-box蛋白家族中一类保守的转录因子家族,参与调控植物的开花时间和花器官发育。通过对黑麦MIKC基因家族的分析,为研究黑麦各时期组织器官的功能奠定基础。利用PFam和BLASTP两种方法确定黑麦MIKC家族共47个蛋白序列,将以上蛋白序列利用TBtools软件进行理化性质、进化关系、保守基序和基因结构、共线性及聚类分析等生物信息学分析。将黑麦47个MIKC基因分为12个亚家族,共线性分析发现黑麦与小麦的共线性基因多于黑麦与水稻间的共线性基因,说明黑麦与小麦的亲缘关系更近。聚类结果结合黑麦物种内共线性分析发现,ScMIKC31基因仅在穗子表达,于其他植物组织器官及发育时期均无表达,选用课题组材料进行RNA-seq验证,结果与生物信息学结果一致,推测ScMIKC31基因为黑麦中与开花有关的基因。以上结果说明MIKC家族基因在黑麦中存在功能分化,为进一步研究该家族基因的功能提供信息参考。     

一个木薯候选STK类抗病基因的分离及其生物信息学分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板,通过PCR扩增,均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列,比对发现,木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测,获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因,命名SSK1。序列分析表明,该基因编码621 aa,有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域,具有典型的STK类抗病基因的保守结构,是一个候选的抗病基因,可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。     

木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。