木荷基因组 SSR 位点开发及初步分析

为开发木荷分子标记,采用高通量测序技术获得木荷基因组原始数据,经生物信息学软件对木荷基因组序列进行序列拼接、组装和对比,共获得 308 418 条 Contig 序列和 459 984 条 Scafford 序列。采用 MISA 软件搜索木荷基因组序列中微卫星（Microsatellite）位点,共得到 334 843 个 SSR 序列,总长度 5 074 708 bp,占木荷基因组大小的 0.98%,木荷基因组 SSR 序列平均长度为 15.2 bp,平均分布频率为 644 个/Mb。木荷 SSR 序列中,单核苷酸序列数量最多,共 188 217 个,占木荷 SSR 序列总数的 56.21%,其次是二核苷酸（23%）>三核苷酸（13%） >四核苷酸（5%）>五核苷酸（2%）>六核苷（1%）。木荷全基因组 SSR 序列中共包括 400 种重复基元,其中单核苷酸重复基元 A 和二核苷酸重复基元 AT 是主要重复基元,分别占总 SSR 的 56%和 11%,SSR 基元的重复次数分布在 4~40 次,主要分布在 4~25 次。本研究丰富了木荷分子标记类型,为进一步群体遗传结构和遗传多样性分析提供了基础数据。     

高粱遗传图谱初探

ＲＡＰＤ（随机扩增多态性ＤＮＡ）是一种新兴的分子标记技术，本实验利用这种技术对高粱（Ｂｔｘ６２３×Ｉｓ３６２０ｃ）Ｆ８重组自交系基因组进行了分析。在３００个随机引物中２８个引物在ＰＣＲ扩增产物的电泳谱带中有差异。其中４２条扩增的多态性位点落于ＲＦＬＰ高粱遗传图谱所需添补的间隔。由此可见，利用ＲＡＰＤ增加ＲＦＬＰ高粱遗传图谱某些区域ＤＮＡ标记的数目是有效的     

巴西橡胶树简单重复序列的鉴定及分离

本研究利用巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）这一重要产胶植物的基因组文库进行了简单重复序列（SSRs），也即微卫星序列的分离鉴定。对来自无性系GT1的小插入基因组文库进行SSRs（AC/TG及CT/GA基序）筛选鉴定共获得154个克隆。采用载体通用引物及重复序列进行PCR扩增发现，其中114个为阳性克隆。限制性酶切分析结果显示，这些阳性克隆中有6个为重复拷贝，故予以剔除。之后，对剩余108个克隆中的50个进行了序列分析。此外，试验中对来自优良无性系RRII105的大插入基因组文库也进行了筛选。所获24个阳性克隆的测序结果也证实了橡胶基因组中微卫星序列的存在。经过最终的序列分析，本研究共鉴定出67个具有不同特点的简单及复合型微卫星序列，其中59个来自GT1，其余8个来自RRII105。所检测到的重复基序包括二核苷酸（TG/AC，AG/TC，TA/AT），三核苷酸（AAG，AGG，ATT），四核苷酸（GAAA，AAGG，ATCC，TAAA，AAAT），以及一个五核苷酸（GAAAT）。与其它作物的报道结果类似，在橡胶基因组中也观察到大量的CT/GA重复。     

大豆遗传图谱研究进展及对应的几个问题

大豆是由古四倍演变而来的二倍体作物 (Ｌａｃｋ ｅｙ ,1980 ) ,其基因组大小为 12 9× 10 9181× 10 9ｂｐ之间 (Ａｒｕｍａｎａｇａｔｈａｎ ,1991)。由于大豆的基因组较大 ,染色体又很小 ,而且细胞在有丝分裂时染色体压缩 ,使细胞不易观察 ,因此 ,大豆的细胞遗传学研究难度较大。另外 ,由于大豆是严格的自花授粉作物 ,其遗传变异程度低 ,导致大豆遗传研究 ,尤其是遗传作图研究 ,与其它作物相比较为落后。ＤＮＡ分子标记出现以后 ,以其数量丰富 ,遗传稳定及操作简单等特性 ,大大促进了大豆的遗传作图 ,使连锁图谱的标记密度越来越大 ,连锁…     

微卫星标记及其在花生上的研究

SSR是一类由1～6个核苷酸组成的短序列首尾相连重复多次构成的一段DNA,广泛分布于真核生物基因组中.SSR标记多态性丰富,操作简单,重复性好,呈共显性.本文对微卫星标记的原理、特点、分离方法及其在花生中的研究现状作简要介绍.     

橡胶树HMG-CoA还原酶基因结构序列分析

橡胶树ＨＭＧ－ＣＯＡ还原酶ｃＤＮＡ序列分析结果表明，该ｃＤＮＡ长段为１３８３ｂｐ，由此推导的氨基酸序列含有４６１个氨基酸残基。ＰＣＧＥＮＥ￣（ＴＭ）分析该ｃＤＮＡ克隆与拟南芥ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶ｃＤＮＡ序列同源性为７９．７％，氨基酸序列同源性为８０．２％，与苍鼠氨基酸序列同源性为５１％，与血吸虫氨基酸序列同源性为４８％。（１）发现ＨＭＧ－ｏｎＡ还原酶的一级结构在动物与植物之间存在较大的差异。（２）分析ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶的疏水性氨基酸图谱，发现橡胶树和拟南芥这两种植物权有１个跨膜势能区域（Ｄｏｍａｉｎ），而血吸虫、苍鼠、果蝇等几种动物却有７个跨膜势能区域，这说明该酶的二级结构在动植物之间也存在着较大的差异。（３）由于所分析的几种动植物ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶的羧基一端未见有疏水性区域，故推测具有疏水性区域Ｎ－端蛋白质与膜相结合，而酶的羧基端由于具有亲水性则起到酶的催化中心位点。（４）比较橡胶树ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶和拟南芥ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶氨基酸同源性，发现蛋白质（酶）的Ｎ－端氨基酸同源性较低，而靠近Ｃ－端同源性较高，这说明Ｃ－端部分较为保守，估计与酶的活性中心区域有关，而Ｎ－端同源性较差，估计跟酶与结合的膜不     

基于甘蔗AP85-441和R570基因组参考序列的微卫星位点鉴定和SSR标记开发

分子标记缺乏是制约甘蔗分子标记技术发展的重要因素。本研究利用甘蔗AP85-441和R570基因组参考序列,使用MISA软件分别鉴定出512 835和97 839个微卫星位点,分别占割手密基因组（AP85-441）和甘蔗基因组（R570）高质量参考序列的0.32%和0.35%。在2个基因组序列中,优势重复单元均为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,各重复单元均以AT富集的基元为主。割手密和甘蔗基因组序列中分别有472 117和89 748个位点可以开发SSR标记。对割手密、甘蔗与高粱基因进行同源性分析,分别鉴定出16 691个和13 271个对应到高粱1~10号染色体上的同源基因,利用基因序列中的SSR位点,开发出13 224和7624对SSR引物。对开发的引物分别以割手密和甘蔗基因组为模板进行e-PCR检测,这些引物在割手密基因组中以多位点扩增为主,在2个基因组中的有效标记比例分别为79.35%和36.13%、79.01%和93.36%。部分SSR引物在基因组中表现出特异性扩增,有1368对仅在AP85-441中单扩增,有1420对仅在R570序列中单扩增,共有752对SSR引物可在2个基因组中单扩增,且这些SSR的扩增位点和来源基因均分布于所在基因组的全部染色体上。在禾本科作物基因组中e-PCR检测表明,开发的单扩增SSR标记具有较好的特异性。本研究鉴定的SSR位点,有助于进一步丰富甘蔗的分子标记;开发的3540对SSR引物对于栽培种甘蔗遗传图谱构建中遗传来源区分和同源连锁群确定具有重要的参考意义。     

大豆EST资源的SSR信息分析

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)存在于表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中.为了在大豆中开发EST-SSR功能性标记,利用生物信息学对NCBI公共数据库中的394 370条大豆ESTs序列进行EST-SSRs特征分析.剔除冗余序列,得到全长为51 332.21 kb的无冗余EST 80 735条.在这些序列中搜索出7 754个SSR,分布于6 674条EST中,出现频率是8.27%.这些EST-SSR的平均长度为15.26 hp,平均分布频率是1/6.62 kb.在1～6 bp的重复基元中,三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(43.72%),其次是二核苷酸(37.34%)、单核苷酸(15.92%).AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复基元,分别占二、三核苷酸重复的62.83%和25.22%.本研究为开发多态性大豆微卫星标记提供了候选序列.     

微卫星标记-准确追踪监测夜蛾属害虫种群的新方法

在澳大利亚 Darling Downs和其它地方最近植棉者遭受到夜蛾属害虫的严重威胁 ,在整个区域比如 Darling Downs地区制定种群水平的管理策略是必需的。研究目标是构建一个关于棉铃虫蛾子的微卫星信息库 (microsatellite library) ,利用这个信息库去研究作物整个生长季节中害虫的种群结构。微卫星是由一小段核苷序列为重复单位组成的核 DNA片段 ,在昆虫基因组中微卫星序列的重复数一般是由其遗传特性决定的。用微卫星序列重复的变异性确定系谱间个体的紧密联系性。在对昆虫种群的研究中 ,通过对一个世代到下个世代可遗传的微卫星序列重复频率…     

大豆EST-SSR标记开发及与Genomic-SSR的比较研究*

本研究对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST-SSR序列39989条, 经拼接得到无冗余EST-SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11.13%和16%,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的无冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST-SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST-SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0.55 和0.44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST-SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

黄淮海地区新育成大豆品系SSR标记多样性分析

分子标记基因型分析是作物品种多样性评估、优异种质发掘与有效利用的重要手段。本研究利用覆盖大豆全基因组的60个微卫星(SSR)分子标记对以黄淮海地区新近育成品系为主的284份大豆材料进行基因型分析,以揭示我国黄淮海地区近期大豆育成品系的遗传多样性特点。结果表明:在供试群体中,60个标记共检测出363个等位变异,每个位点平均有6.05个;PIC指数变异范围为0.297~0.849,平均为0.614。黄淮海地区大豆新品系平均每个位点等位变异为5.75,PIC指数平均为0.604,表现出较高的多样性水平;不同省区中,北京、河北材料多样性最高。基于SSR数据的聚类分析,可将供试材料分为5大类,聚类结果与品系的地理来源相关。进一步选出8对SSR引物能够区分供试材料,可用于构建指纹图谱。     

SSR荧光标记毛细管电泳法与国家冬油菜区试指纹鉴定平台的构建

为了提高油菜品种指纹检测的精确性及未来构建大规模油菜新品种指纹数据库的需求,应用SSR荧光标记毛细管电泳检测法构建国家冬油菜区试指纹鉴定平台。以40对荧光引物对2012-2013年度163份国家冬油菜区试参试品种（系）进行分析。结果共检测到42个等位位点和131个等位变异。其中A基因组（n1～n10）检测位点25个,C基因组(n11～n19)检测位点17个。每个位点等位变异数从2到6不等,平均为3.02。42个检测位点的PIC值变化范围在0.10～0.69之间,平均值为0.36。其中引物BRGMS171的杂合度、PIC值分别高达0.67、0.70,可考虑作为以后区试杂交种纯度鉴定的核心标记。SSR位点的纯合度分析得出本年度18份常规种平均纯合度为81.9%,145份杂交种为57.9%。以131个等位变异计算品种（系）间DICE相似系数,163份品种（系）间平均遗传相似系数变幅为0.607～0.765,变幅最大的为品种（系）FC03（0.438～0.879）,变幅最小为品种（系）宜油21（0.611～0.806）。     

基于SSR标记的四川大豆与引进大豆资源遗传多样性和群体结构分析

利用均匀分布于20条染色体的53对SSR标记(每条染色体上2~5对),对190份大豆资源进行遗传差异检测,随后根据标记试验结果进行遗传多样性分析、聚类分析、PCA分析和群体结构分析。53对SSR标记共检测到159个等位变异,每个位点等位基因范围为2~6个,平均每个位点的等位基因为3个,有效等位基因数Nei为1.474 4±0.237 5,多态性信息含量PIC为0.305 0±0.105 6;Shannon-Weaver指数值为0.476 2±0.124 9。这些参数显示了190份大豆资源异质程度不是很高,遗传多样性丰富程度一般,总体遗传多样性处于中等水平。UPGMA聚类分析结果显示190份大豆资源(群体1:P1)被分为3个大类,且四川审定大豆品种与野生大豆资源、国外引进资源亲缘关系较远,随后将四川审定大豆品种31份、国外资源13份和野生大豆资源8份共52份材料(群体2:P2)单独进行聚类分析,52份材料也被分成3个大类。群体1和群体2分别在K=3,K=2时得到合理群体结构。群体1的3个亚群分别是:亚群I由地域来源丰富的78份材料组成,不包含野生大豆资源;亚群II 59份材料中含7份野生大豆资源;亚群III 53份材料只包括1份野生大豆资源zy05292。群体2分成两个亚群:亚群Ⅰ26份材料中含24份四川审定大豆品种和2份国外资源;亚群II包含了6份审定大豆品种。供试的190份大豆资源蕴含了比较丰富的遗传变异,显示了较高水平的基因多样性。群体结构不能严格地按照地域、来源国家的划分而区分,这一现象显示了大豆资源存在着广泛的基因交流。从分析结果来看,四川大豆资源的种质创新可以充分地利用国外引进资源与直立型野生大豆资源,进而丰富四川大豆的基因多样性。     

辽宁省野生大豆种质资源的SSR遗传多样性分析

以30份2007年辽宁省的野生大豆种质资源为材料,利用40对SSR引物进行遗传多样性分析。结果表明:18对SSR引物扩增出129个等位变异,平均每个位点等位变异7.22个,Shannon-Weaver指数变化范围为1.1753~2.1234,平均为1.7285。中部平原半湿润区内的种质数、平均等位变异数和遗传多样性指数最高,其次为东部山地湿润区,西部丘陵半干旱区内分布种质数最少,其平均等位变异数和遗传多样性指数均最低。中部平原半湿润区和东部山地湿润区之间的遗传相似性最高(0.6496),遗传距离最近(0.4314),而西北部平原低丘半湿润区和西部丘陵半干旱区之间的遗传相似性最低(0.4326),遗传距离最远(0.8379)。聚类结果看到SSR分子标记的结果与品种的地理来源没有明显的相关性。     

玉米全基因组批量化SSR多态性标记开发及PCR扩增验证

简单序列重复在真核生物的基因组中含量非常丰富,且常常随机、均匀分布于整个基因组中。SSR标记广泛应用于动、植物基因定位、群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择等方向。随着大量全基因组序列的公布,NCBI等数据库中可利用的序列信息量激增。但在常规分子生物学研究中,仍然延续传统的小规模SSR标记开发模式,开发标记数量非常有限、效率较低。结合MISA脚本指令、Primer3引物设计软件、e-PCR特异性扩增分析软件,对玉米全基因组水平SSR位点进行搜索、引物设计、特异性扩增分析以及扩增长度差异分析,开发高密度的SSR标记。通过引物合成、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,从常规分子生物学水平验证所开发标记的可靠性。     

基于SSR标记关联分析挖掘大豆灰斑病10号生理小种抗病资源

培育灰斑病抗性品种可降低灰斑病对大豆生产的危害。本研究以202份黑龙江省近25年主栽的大豆品种构建关联群体,在人工接种条件下鉴定大豆品种对灰斑病10号生理小种抗病指数。利用187对SSR标记对遗传多样性、群体结构和连锁不平衡位点进行分析,通过GLM 和MLM两种模型对大豆品种的灰斑病抗性与标记进行关联分析,进一步分析抗性关联位点等位变异与抗性表型效应关系。结果表明：202份大豆品种对灰斑病10号生理小种抗性遗传变异系数为14.26%;187个标记在群体中共获得809个等位变异,平均等位变异为4.42个,变幅2~10个,其中17号染色体的平均PIC值最高（0.64）,12号染色体的平均PIC值最低（0.26）;检测到稀有等位变异146个,特有等位变异位点58个;无论共线性组合位点还是非共线性组合位点均存在不同程度LD,连锁不平衡P<0.05支持的对数占总对数的21.65%;202份大豆品种被划分为3个亚群,亚群POP1与POP3之间遗传距离最小（0.03）,亚群POP2与POP3之间遗传距离最大（0.35）;两种模型共同检测到11个SSR标记与灰斑病10号生理小种抗性显著关联,其中位于3号染色体上的Satt549的贡献率最大,可解释表型变异14.74%;具有增效效应的等位变异共有24个,增效效应超过10的等位变异有7个,增效效应最大为Satt703-247（19.62）,典型载体材料为合丰29;其次是Satt587-185（19.58）,典型载体材料为东农50;Satt549位点增效等位变异的平均效应值最高（13.87）,Sat_366位点增效等位变异的平均效应值最低（0.84）。聚合优异等位变异和载体材料可为培育抗灰斑病品种的亲本选配和后代等位条带辅助选择提供依据。     

20份特用玉米自交系亲缘关系的SSR标记研究

利用SSR标记研究了20份特用玉米自交系的亲缘关系。用15对扩增带型稳定的SSR引物,从供试材料中检测出67个等位基因变异,每对引物检测等位基因2～10个,平均4.66个。SSR引物的PIC介于0.43～0.88之间,平均多态性信息量为0.675。UPGMA方法聚类分析表明,甜玉米和糯玉米亲缘关系最近,个别爆裂玉米与糯玉米亲缘关系较近,大部分爆裂玉米与前两者的亲缘关系很远。     

稻属AA染色体组8个种间SSR多样性与亲缘关系

选用平均分布于水稻基因组的30对SSR 引物,对AA染色体组8个野生稻种共42份材料的遗传多样性及遗传关系进行了研究。结果显示,本试验选取的30个SSR标记均具有多态性,多态性位点百分率为100%。30个多态性位点共扩增出的等位基因数为224, 每个位点可扩增出3～10个等位基因,平均7.47个;等位基因有效数(Ae)变幅为1.25～891,平均5.45。多样性指数中,Shannon多样性指数(I)为0.454～2.386,平均1.826;而Nei基因多样性指数变幅为0.199～0.888,平均0.774。系统聚类和带型分析结果表明,亚洲栽培稻(Oryza sativa) 与普通野生稻(O. rufipogon) 的亲缘关系最近,非洲栽培稻(O. glaberrima) 则与巴蒂野生稻(O. barthii) 关系最为密切,杂草稻(O. spontanea) 与普通野生稻 (O. rufipogon)、亚洲栽培稻(O. sativa) 之间有较近的亲缘关系,而展颖野生稻(O. glumaepatula)、长雄蕊野生稻(O. longistaminata)与AA组其他稻种之间的亲缘关系较远。     

黑龙江省大豆推广品种农艺和品质性状优异等位变异的发掘

发掘推广品种的农艺和品质性状优异等位变异和载体材料可为培育优质大豆品种提供遗传信息和育种资源。本研究以200份黑龙江省近年大豆推广品种为试验材料,利用187对SSR标记进行全基因组扫描,分析群体结构,采用TASSEL软件的GLM方法对标记与3个农艺性状、蛋白质含量及油分含量进行关联分析。结果表明：10 个SSR标记与百粒重关联,其中表型效应值最大的优异等位变异为Sat-149-192,载体材料为东农57;8个SSR标记 与株高关联,表型效应值最大的等位变异是Satt413-206,载体材料为赤豆1号;13个SSR标记与生育期关联,表型 效应值最大的等位变异是Satt631-180,载体材料为黑农61;5个SSR标记与油分含量关联,表型效应值最大的等位 变异是Satt234-138,载体材料为合丰55;9个SSR标记与蛋白质含量关联,表型效应值最大的等位变异是Satt632- 293,其载体材料为东农43。上述等位变异的信息为培育提供了亲本选配和后代等位条带辅助选择的依据。     

一粒小麦种质遗传多样性分析

为了从野生一粒小麦中发掘有用基因,随机选取33个普通小麦EST-SSR标记和定位于小麦A基因组的41个普通小麦基因组DNA-SSR标记,对35份一粒小麦、3份四倍体小麦和1份普通小麦进行了遗传多样性分析。结果表明,在扩增这些标记位点的引物中有45对在一粒小麦上有扩增产物,其中33对检测出位点多态性,而且基因组DNA-SSR标记的多态检测率明显高于EST-SSR标记多态检测率。这些多态位点包括211个等位位点,平均每个位点有6.03个等位变异。利用PHYLIP分析软件按UPGMA方法对这些一粒小麦种质进行了聚类分析,以遗传距离0.5为界,可以将其分为7种类型。这种聚类关系与对应种质的白粉病抗性呈现出一定的相关性,因此根据聚类结果可以在一定程度上推测相关种质所携带的抗白粉病基因的起源和变异。对一粒小麦与野生二粒小麦种质的遗传距离的分析结果表明,不同来源的二粒小麦的A基因组可能有不同的起源。