环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038

为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景.     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性

利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。     

转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

转基因玉米(Zea mays)MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶甲虫(Diabrotica virgifera)和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系,本研究的目的是建立该品系的转化事件特异性定性检测方法的标准.根据转基因玉米MON88017的旁侧序列信息,在左边界的结合位点处设计一系列引物组合,在筛选出最佳引物组合后,优化了该引物组合的反应体系,建立了转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法.全国7家实验室的验证结果表明,该方法能够特异性检测样品中MON88017转化事件,检测灵敏度均达到0.10%以上,且检测结果具有良好的可重复性、可重现性.本方法符合标准检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求,为我国抗虫耐除草剂玉米MON88017检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑.     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立

随着越来越多的转基因作物及其产品进入人类生活的各个领域,准确、快速、高效的检测转基因作物及其产品成为转基因研究和安全管理的基本要求。为了建立抗两种除草剂转基因水稻(Oryza sativa)EB7001S的事件特异性检测方法,本研究利用高效热不对称PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL-PCR)和长距离PCR法(long-distance PCR,LD-PCR)扩增获得了转基因水稻EB7001S中外源基因插入位点的旁侧序列,其中:右旁侧序列1 515 bp,左旁侧序列1 460 bp,外源基因插入水稻基因组第7号染色体第1 470 725位。以左右旁侧序列为基础,建立了转基因水稻EB7001S的事件特异性定性PCR检测方法,采用该方法可从转基因水稻EB7001S中扩增到458和629 bp的2条特异性目的片段。该方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,在模板中掺入EB7001S基因组DNA的量为0.1%时仍能通过普通PCR方法检测出来。以旁侧序列为基础,还建立了能快速、准确鉴定外源基因纯合株系的三引物PCR检测法。这些检测方法的建立,将为转基因水稻EB7001S的利用和检测提供关键技术基础。     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

转基因棉花GHB119品系特异性定量PCR检测方法的建立

为了保障和促进我国口岸进口转基因产品安全相关法律法规的顺利实施,针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的棉花品系GHB119,本研究利用TaqMan实时荧光PCR(Real-time PCR)技术,根据转基因棉花(Gossypium sp.)GHB119 3'端外源插入片段与棉花基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,并对引物、探针以及扩增体系进行了筛选和优化,建立了转基因棉花GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法特异于转基因棉花GHB119成分检测,检测下限(limit of detection,LOD)为10拷贝的基因组DNA,定量下限(limit of quantification,LOQ)为25拷贝GHB119基因组DNA,对盲样的定量结果显示,测定值与设定值间的偏差(bias)、标准偏差(standard deviation,SD)、相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)等均在可接受范围内。本研究建立的GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对混合样品中转基因棉花GHB119成分进行定量检测分析。     

转基因产品检测技术研究进展

对转基因产品的定性PCR、定量PCR、酶联免疫吸附及其它检测技术进行了系统阐述,综述了转基因产品品系特异性检测技术、内标基因、标准物质及影响检测的抑制因子等已2v取得研究进展,指出了当前转基因产品检测技术存在的问题及未来的发展前景。     

转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号的旁侧序列和品系特异性检测

为更好地了解我国转基因棉花的转化品系,建立快速准确的品系鉴别方法,本研究采用长链PCR、Genome Walking的方法解析转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)新转化品系鄂杂棉1号的整合结构和外源DNA整合的基因组旁侧序列.以旁侧序列为靶标,设计引物,对引物的筛选优化、特异性和灵敏度测试结果显示,建立的鄂杂棉1号品系定性PCR检测方法具有特异性,检测灵敏度为40个拷贝,相当于100 ng模板的0.1%.对市场的21个样品棉花样品检测,有3个样品检测出具有与"鄂杂棉1号"相同转化品系来源,表明本研究建立的品系特异性检测方法可应用于我国转基因棉花育种材料的鉴别和筛选.     

利用复合PCR方法同时检测三种转基因水稻

我国在转基因水稻研究方面处于国际领先地位,但由于研究材料扩散到商品化生产水稻中而引起的贸易纠纷时有发生。加强转基因水稻检测与监管,从源头控制转基因水稻基因扩散对于保障生物安全、促进米制品贸易有重要意义。本研究针对我国当前转基因水稻监管重点,结合已有相关检测方法标准,针对三种不同转基因水稻：抗虫水稻TT51-1、抗病水稻M12、抗除草剂水稻LLRICE62,以水稻内源基因RBE4为参照基因,建立转基因水稻四重复合PCR检测方法,可在同一反应体系中同时检测鉴定三种转基因水稻品系,检测限可达250个拷贝。利用此方法可快速地定性检测和鉴定转基因水稻TT51、M12、LL RICE62。     

转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cryIAc基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用.目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道.为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测方法.所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态.建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝.用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体.采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定.结果表明,有1份含量在1.5％左右,4份含量超过了20％,两种方法的测定结果基本一致.本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值.     

利用放射免疫技术快速检测转基因植物

利用PCR分别合成掺入地高辛标记的35S启动子和NOS终止子核酸探针，再利用放射免疫技术将I^125标记的地高辛抗体与35S启动子和NOS终止子探针分别进行杂交检测。结果显示转基因样本的杂交信号均为阳性，且灵敏度较高。特异性强，为转基因植物的分析检测又提供了一种较实用的方法。     

Detection of Genetically Modified Soy in Doughs and Cookies

In many countries, including the European Union member states, Switzerland, Australia, New Zealand, and Japan, legislation has been set up for labeling of genetically modified organisms (GMOs) in food and feed products. To comply with these regulations, reliable detection methods are necessary. If the detection is based on DNA, a GMO analysis may contain several steps where qualitative and quantitative species-specific, GMO screening, GMO construct, and GMO line-specific polymerase chain reactions (PCRs) are used. A limit of detection (LOD) thereby defines to what extent a target molecule may be detected in a sample. In this study, cookies were made with variable levels of a soy sample containing 2 wt% Roundup Ready soy. For all PCRs described, detection limits based on dilution series and practical LODs were determined. The practical LODs are used to determine to what extent a GMO ingredient may be detected in a real food product. Results reveal that, due to the baking process, the overall DNA fragment length is reduced, rendering GMO analyses more difficult. Furthermore, Roundup Ready soy line-specific and real-time quantitative PCR are less sensitive than GMO screening PCRs, whereas just these PCRs are crucial in the decision-making process regarding the presence of GMOs in a food product. Moreover, high standard deviations and errors render the precise quantification of GMOs difficult.     

蜂蜜中转基因成分的PCR检测

我国是蜂蜜生产大国,棉花是主要蜜源植物之一。近些年来,我国种植的棉花大多为转基因抗虫棉,棉花蜜中是否含有转基因成分,引起国内外广大消费者的密切关注。本文以抗虫棉种植地采取的棉花蜜为原料,采用改良CTAB法,在DNA提取过程中,用PBS缓冲液除去其中大部分的可溶性多糖,并提高CTAB提取缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,从蜂蜜中成功提取出片段完整、纯度较高的DNA,DNA得率为486ng/mL,OD260/OD280为2.01,能够满足后续PCR定性检测的需求。从以转基因棉花为蜜源的蜂蜜中检测出外源DNA片段,建立了蜂蜜中转基因成分的PCR检测技术。本研究对转基因食品标识制度的完善、转基因食品监管、减少贸易摩擦以及保证消费者权益等具有重要意义。     

转基因产品中抗除草剂基因的PCR检测

抗除草剂作物占全球转基因作物的75％以上，并且这类作物还有不断增加的趋势。首次建立并优化了对4类转基因作物（大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、棉花（Gossypium hirsutnm）和油菜（Brassica campestris var.oleifera））的5种外源抗除草剂基因（bar、pat、cp4-epspsI、cp4-epsps2和gox）的PCR检测方法，并在实践中应用。结果表明，本方法灵敏特异、结果准确可靠，可对目前批准的所有抗除草剂转基因产品进行定性检测。