鸡C/EBPα抗血清制备及组织表达的特性

制备鸡（Gallus gallus）CAAT增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα）的多克隆抗血清,并分析其组织表达特性。通过限制性酶切,从T-C/EBPα质粒中获得C/EBPα基因的编码区序列（coding sequence,CDS）,构建原核表达载体,以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主,用IPTG诱导重组pGEX6p/C/EBPα的表达,经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗鸡C/EBPα多抗。ELISA方法测定抗体效价达1∶12800,Western blot方法显示抗体具有较高的特异性。用此抗血清分析了鸡C/EBPα的组织表达特性,结果表明,鸡的回肠、肾脏、肌胃、腺胃、心脏、肝脏、腹脂、脾脏等组织中C/EBPα蛋白表达量较高,而在胸肌、腿肌中表达量较低。同时分析C/EBPα基因在高低脂系公鸡肝脏组织中的表达差异,结果显示该基因在低脂系公鸡肝脏中表达量较高。     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

草莓果实特异表达基因annfaf 在E. coli 中的表达及抗血清的制备

摘要：将草莓?穴Fragaria ananassa Duch. ?雪果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf 基因转化大肠杆菌(E. coli )后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明, 最佳培养温度是37 ℃ ，培养时间为4 h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS-PAGE检测表明该蛋白分子量为35 kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。     

脱氢表雄酮(DHEA)对鸡胚原代肝细胞cAMP/PKA信号通路和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的影响与调节

控制肉鸡脂肪过多沉积是肉鸡生产中亟待解决的问题。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是人体分泌最为丰富的肾上腺类固醇激素,可经由类固醇激素受体介导发挥生理功能,降低机体生脂能力。本研究以鸡胚原代肝细胞为研究对象,选用含DHEA终浓度为0(对照)、0.01、0.1、1.0、10和100μmol/L的培养液孵育肝细胞20min后收集细胞,放射免疫测定法(RIA)检测胞内cAMP水平。结果发现,0.1～100μmol/L DHEA孵育肝细胞均可显著提高胞内cAMP水平(P<0.05),其中0.1μmol/L DHEA效果最为显著(P<0.01)。0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min或1h后收集细胞,RIA法分别检测胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性,(γ-32P)ATP掺入法测定cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,Western blot法测定cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平。结果显示,0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min可显著降低胞内PDE活性(P<0.05),提高PKA活性(P<0.05),但对AC活性无显著性影响(P>0.05)。0.1μmol/L DHEA处理肝细胞1h可显著提高CREB蛋白磷酸化水平(P<0.05),且这种效应可被PKA抑制剂阻断(P>0.05)。本研究结果提示,DHEA调控肉鸡肝脏脂肪代谢,降低脂肪沉积的机制可能与激活胞内cAMP/PKA信号系统,活化转录因子CREB有关。     

番茄双链RNA绑定蛋白(SlDRB)基因家族鉴定及抗TYLCV防御反应分析

番茄生产是现代蔬菜生产的主导产业,因经济价值高,成为乡村振兴的优势产业.然而番茄生产大多面临番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和其他病毒的严重威胁.最新研究发现双链RNA结合蛋白(DRB)在植物RNA干扰(RNAi)抗病毒通路中发挥重要作用.为探究番茄DRB(SlDRB)基因抗TYLCV防御反应,本研究通过生物信息学方法鉴...     

葡萄糖和含腺苷分子通过碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)诱导猪脂肪细胞硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)的表达

硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)是一种氧化还原调节蛋白,通过与硫氧还蛋白结合抑制其活性,调节细胞的氧化还原状态,在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用。本研究利用从3~7日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,应用RNAi沉默碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达,以含0或0.1 mmol/L NAD+的葡萄糖浓度分别为0、5和15 mmol/L的培养液培养,采用实时荧光定量PCR检测Txnip及ChREBP mRNA表达,以探讨葡萄糖和含腺苷分子对猪脂肪细胞Txnip表达的影响及其转录调控途径。结果表明,葡萄糖以浓度依赖方式促进猪脂肪细胞Txnip和ChREBP mRNA表达,无糖条件下NAD+对Txnip mRNA表达没有明显影响,但葡萄糖存在时显著促进其表达。siRNA沉默脂肪细胞ChREBP表达后,葡萄糖对Txnip mRNA表达的促进作用比相同条件下培养的对照细胞有较大幅度降低;以NAD+处理后,Txnip表达在葡萄糖浓度为5和15 mmol/L时分别较对照细胞降低了91%和93%。由此说明,NAD+诱导猪脂肪细胞Txnip转录表达依赖于葡萄糖的参与,ChREBP介导葡萄糖和NAD+对Txnip mRNA表达的诱导作用。研究结果为进一步探讨ChREBP在葡萄糖和脂质稳态中的作用提供了基础。     

结核分枝杆菌输出重复蛋白(Erp)8基序突变体的构建及表达分析

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的古老疾病,与艾滋病、疟疾一并成为当今世界威胁人类健康的三大传染病。输出重复蛋白(Erp)是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子,在临床上具有一定的潜在应用价值。为了深入研究Erp的功能,本研究采用固相亚磷酰胺三酯化学方法合成包含8个PGLTS基序的基因Dom8,并利用重叠延伸PCR的方法将该片段与DomC(长度为520～855bp)连接,经基因组装得到Erp蛋白8基序突变片段。进一步对获得的8基序全长基因进行C端、N端及CN两端缺失突变体,将其构建至原核表达载体pET-28a(+)上,将经酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pLysS菌株中。利用Tricine/SDS-PAGE、Western blot检测结核分枝杆菌Erp重组蛋白的表达情况。结果显示,通过重叠延伸PCR法成功扩增了erp基因PGLTS8基序全长及8基序C-端、N-端和CN-端缺失突变体并构建至原核表达载体,经IPTG诱导后,用Tricine/SDS-PAGE得到大小分别约为13.0、17.1和6.7kD的目的蛋白。制备弗氏佐剂疫苗免疫试验兔,ELISA测定抗体效价,血清效价达到1:512倍时,即可心脏采血分离,制备抗血清,并对提取的蛋白进行Western　blot检测,结果表明,一抗为l:200倍稀释的兔阳性血清,二抗为1:800倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG-HRP;Western blot检测ErpMutC8、MutN8和MutCN8,结果显示,仅目的蛋白ErpMutC8和MutN8能被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,表明,BL21(DE3)pLysS(pET28a-C8)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-N8)所表达目的蛋白表达特异,可以被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,具有良好的抗原性。研究结果为深入研究Erp的功能,制备结核病的诊断抗原和基因工程重组疫苗提供基础资料。     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒分离物外壳蛋白基因的克隆、原核表达及特异抗血清的制备

利用RT-PCR获得苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）库尔勒香梨分离物外壳蛋白（CP）基因。经序列分析表明，库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）分离物CP基因由582个核苷酸组成，编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质（GenBank accession No．AY669389）。将其克隆到表达载体pET-28a（＋）中，转化大肠杆菌（Eschedchia coli）BL21，筛选得到阳性克隆pET-ACP。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表明，预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达。回收原核表达的目的蛋白，免疫家兔，制备了ACLSV外壳蛋白的特异性抗血清。Western blot分析表明，所制备的抗血清可用于检测样品中的ACLSV。     

大口黑鲈高密度脂蛋白结合蛋白基因(HBP)SNPs的筛选及与生长性状关联性分析

高密度脂蛋白结合蛋白(high density lipoprotein binding protein,HBP)在动物的脂肪代谢中发挥重要的作用。脂类是鱼类的重要能源物质,尤其是那些对糖类利用率很低的肉食性鱼类。HBP基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可能会影响脂肪代谢,而对大口黑鲈的生长性状产生影响,研究其SNP与生长性状的相关性可为其分子标记辅助选择提供候选标记。本研究根据大口黑鲈(Micropterus salmoides)EST-SNP库中HBP基因的序列(GenBank accession No.KF652241),用直接测序法在HBP基因3'非编码区获得了3个SNPs位点:H1(G+2782T),H2(T+2817C)和H3(G+2857A);随机选择同批繁殖、同塘养殖的165尾大口黑鲈样本,对3个SNPs位点用SnaPshot方法进行检测和分型,分型结果用软件Popgene32进行遗传结构分析;运用软件spss17.0的一般线性模型(general linear model,GLM)对获得的不同基因型与生长性状进行关联分析。结果表明,3个位点均处于哈温平衡,其中H1和H2位点组成了两种单倍型(A和B),观测到3种基因型(AA、AB和BB);H1、H2和H3共组成6种双倍型(D1、D2、D3、D4、D5和D6)。不同基因型与生长性状的相关性分析显示,基因型BB在体质量和全长形态指标显著高于基因型AB(P0.05),双倍型D6在体质量和全长形态指标显著高于双倍型D4(P0.05)。本研究在大口黑鲈HBP基因3'非编码区获得了与生长性状相关的SNPs标记,可应用于大口黑鲈分子标记辅助选择育种。     

鸡胃肠道生长抑素(SS)mRNA表达的组织特异性

以30dArborAcre(AA)肉鸡为模型,采集胃肠道样品,采用相对定量RT-PCR方法研究了生长抑素(SS)mRNA在鸡胃肠道分布的组织特异性。结果表明,腺胃SSmRNA的表达量高于所有肠段,差异极显著(P<0.01);十二指肠和空肠SSmRNA的表达丰度相似,二者均显著高于回肠(P<0.05)。定性研究显示,肌胃和结直肠均有SSmRNA表达,但其表达量显著低于腺胃、十二指肠、空肠和回肠。SSmRNA在主要的消化(腺胃)、吸收(十二指肠和空肠前段)器官的高丰度表达,提示SS对营养物质的消化吸收具有重要的调控作用。异性     

绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA的克隆、表达及其结构模拟分析

为探讨绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)在不同生长阶段背最长肌中的表达特性,本实验以成年小尾寒羊(Ovis aries)皮下脂肪组织总RNA为实验材料,在脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA保守区域设计1对引物Ff和Fr,采用RT-PCR方法克隆了绵羊FABP4全编码序列,并运用生物软件对FABP4蛋白空间结构进行分析.同时运用实时荧光定量PCR法,对FABP4在皮下脂肪和背最长肌中的表达以及不同日龄在背最长肌中的表达量与背最长肌肌内脂肪含量的相关性进行了初步研究.结果表明:绵羊FABP4基因cDNA长度为464bp,包含1个由399 bp组成的开放阅读框,编码132个氨基酸.生物信息学分析表明,不同物种间FABP4氨基酸序列具有较强的保守性,蛋白质空间结构呈2个α螺旋和10个β折叠围绕的桶状构型.实时荧光定量PCR试验表明,FABP4基因在160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量明显高于90日龄背最长肌的表达量(P＜0.05);且在90、120、160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量与相应日龄的背最长肌肌内脂肪含量呈正相关(R2=0.7196,P＜0.01).本研究结果表明,调控FABP4基因在背最长肌的表达是改善绵羊肉质的潜在途径.     

鸡下丘脑高丰度差异性表达let-7a的组织表达谱及其功能分析

前期对固始鸡1日龄和36周龄下丘脑miRNA的Solexa测序分析表明,let-7a为鸡(Gallus domesticus)下丘脑发育过程高丰度差异性表达miRNA.为全面了解鸡let-7a的功能,采用实时定量PCR检测了1日龄和36周龄固始鸡两个发育阶段13种组织中let-7a的表达情况.结果表明:let-7a在所检测的组织中呈广泛性表达,其在下丘脑中的表达趋势与高通量测序结果一致;1日龄时,let-7a在下丘脑和肾脏中高丰度表达,在肺中低丰度表达,其他组织中适度表达;36周龄时,let-7a在各组织中的表达量都较低,除了在肺中的表达量较1日龄上升外,其余各组织的表达量都下降.同时,采用两种算法预测了let-7a的靶基因,并对107个共有靶基因进行了基因本体功能(Go)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,结果显示:靶基因主要在生物学过程调节相关的生物学过程中富集,尤其是与矿物质和磷代谢相关的调节过程;且在粘着斑、细胞外基质受体互作、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等3个通路中显著富集(P＜0.01).这些结果为进一步研究let-7a功能提供了有益线索.     

Preparation of Bioactive Recombinant Chicken Leptin Fusion Protein

将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSET A的Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ两位点之间，构建重组表达质粒pLep -SCAU2并转化大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素100 μg/mL 的LB培养基中培养至OD600大于0.6之后，经IPTG 0.05 mol/L诱导表达出分子量约为17.5 kD的含6×His标记的重组鸡Leptin，诱导4 h后表达量达最高，占总菌体蛋白的25％左右,且以包涵体形式存在。该重组鸡Leptin经50％Ni-NTA树脂纯化和透析复性折叠后分离出可溶性部分。对35日龄的矮脚黄鸡腹腔注射该可溶性重组鸡Leptin（2 mg/kg 体重）；注射后60 min内的采食量与对照组差异不显著 （P > 0.05），但在注射后80~120 min都显著低于对照组（P < 0.05）。Leptin处理公鸡的采食量在注射2 h后逐渐上升并在5.5 h时与对照组公鸡相同。但Leptin处理母鸡的采食量持续受到抑制，在注射后5.5 h时仍然显著低于对照组母鸡（P <0.01）。表明所表达的重组鸡Leptin能显著抑制鸡的采食量（母鸡比公鸡效果更为明显），证明所制备的重组鸡Leptin融合蛋白具有生物学活性。     

稻褐飞虱呼肠孤病毒的核酸结合蛋白

采用Northwestern分子交杂方法，研究了稻褐飞虱呼肠孤病毒（NLRV）结构蛋白的功能，结果证明被推测为RNA聚合酶的P1蛋白、B突起的P2蛋白、NTP结合的P7蛋白和主要的病毒外层蛋白的P8蛋白是非特异性核酸结合蛋白，具有与单链或双链RNA和DNA4种核酸结构的能力，暗示了这4种蛋白在NLRV病毒核酸复制，病毒粒子包装中起作用。     

猪RBP1和RBP4基因的定位、组织表达谱分析、多态研究及相关分析

类维生素A（维生素A及其代谢产物）在动物的视觉、生长、繁殖、细胞的分化及胚胎发育等方面起重要的作用。利用猪的辐射杂种克隆板，将猪细胞视黄醇结合蛋白基因1（RBP1）和猪血浆视黄醇结合蛋白基因4（RBP4）分别定位在猪13号和14号染色体上。利用半定量RT－PCR方法，对这两个基因在成年五指山猪十二种不同组织（肺、骨骼肌、脾、心脏、胃、大肠、淋巴结、小肠、肝、大脑、肾、脂肪）的组织表达谱进行了分析。在猪的血浆视黄醇结合蛋白基因4中，发现一个单核苷酸多态位点（RBP4-A/G156），并用基于聚合酶链式反应的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)，对这一多态在莱芜黑猪、五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪和通城实验猪群中的分布进行了研究。在通城实验猪群中，进行了不同基因型与性状间的关联分析，发现其不同的基因型与胴体直长、胴体斜长、血红蛋白浓度、平均血细胞血红蛋白量、达上市体重日龄高度相关。在猪的生产和育种中，这一多态位点可能会成为有用的分子标记。     

In Vitro Bile Acid Binding Capacity of Wheat Bran with Different Particle Sizes

The bile acid binding capacity of wheat bran with different particle sizes was determined. Unmilled wheat bran with an average particle size of 900 μm (WB‐900), milled wheat bran at two particle sizes, 500 and 200 μm (WB‐500 and WB‐200), and all three bran samples washed with water (WWB‐900, WWB‐500, and WWB‐200) were mixed with bile acids at pH 6.3 to determine their in vitro adsorption capacity. On a dry matter basis, the order of relative bile acid binding values was WB‐900 ∼ WB‐500 > WWB‐900 > WB‐200 > WWB‐500 > WWB‐200. Data suggests that the surface area as measured by the Brunauer–Emmett–Teller (BET) method and water holding capacity may significantly affect the bile acid binding capacity of wheat bran. As the BET surface area increased with decreasing particle size, the water holding capacity and bile acid binding decreased. Bile acid binding capacity of wheat bran appears to be linked to the ability of the samples to physically adsorb the bile acids. Bile acid binding capacity significantly decreased with reduction in particle size of wheat bran after water washing.     

鸡胚致死孤儿病毒Ⅲa蛋白基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

通过随机引物PCR鉴定了鸡(Gallus domesticus)胚孤儿致死病毒(CELOV)污染鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。根据GenBank上已公布的核苷酸序列，自行设计一对引物。PCR扩增到1728bp的特异性条带，将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达，产物蛋白经Western blot鉴定为阳性后，又长程免疫小白鼠获得抗Ⅲa蛋白的抗血清。间接免疫荧光实验(ⅢA)鉴定蛋白产物具有抗原性。