表皮生长因子（EGF）对牛前脂肪细胞增殖和分化的影响

以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化.     

猪成熟脂肪细胞分离培养及去分化研究

成熟脂肪去分化技术可为研究脂肪细胞分化提供均一的前体脂肪细胞。本研究分离培养了猪成熟脂肪细胞,并去分化为前体脂肪细胞。本实验采用Ⅱ胶原酶消化后离心分离1~3日龄仔猪(Susscrofa)皮下脂肪组织,天花板法培养获得成熟脂肪细胞。显微镜下观察脂肪细胞去分化形态学变化,并在成脂诱导培养液的作用下诱导再分化。采用油红O染色法检测分化不同时期细胞脂滴聚集效率,脂滴的累积随诱导的进行不断增加。RT-PCR检测成熟脂肪细胞标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARγ)和和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的mRNA相对表达量,分化早期基因表达水平较低,其表达水平在分化过程中持续增高,在分化后期PPARγ相对表达量与诱导分化前增加了2.8倍,FABP4增加了约62倍(差异显著P<0.05)。说明去分化获得的前体脂肪细胞在成脂诱导培养液作用下,可有效地分化为成熟脂肪细胞。本研究优化了猪成熟脂肪细胞分离和培养体系,并通过去分化获得具有再分化能力的前体脂肪细胞,为进一步深入研究猪脂肪细胞分化与代谢提供技术平台。     

RXRα对猪前体脂肪细胞凋亡的影响

采用AO和Hoechst 33342荧光染色及流式细胞术等方法,检测在体外培养的猪前体脂肪细胞中添加RXRα配体9-cisRA、转染pRXRα-EGFP和RXRα-siRNA后猪前体脂肪凋亡的变化。结果表明,猪前体脂肪细胞发生凋亡的形态学变化,细胞首先体积缩小,细胞浆凝缩,染色质逐渐凝集,细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,胞膜仍完整,然后胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体;10 nmol/L 9-cisRA和pRXRα-EGFP组与对照组相比,凋亡率被显著降低（P0.05）;10 µmol/L 9-cisRA和RXRα-siRNA组凋亡率则显著高于对照组（P0.05）。结果指出, RXRα具有抑制猪前体脂肪细胞凋亡的作用。     

不同浓度PVP对猪前体脂肪细胞冷冻保存的效果

猪前体脂肪细胞是研究人类肥胖及其相关的糖尿病、高血压等疾病最合适的材料之一,但目前尚未建立猪的前体脂肪细胞系。原代培养的猪前体脂肪细胞生长周期较长,且在常规培养条件下难以长期保存,如能将细胞在超低温条件下保存,使其生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡(薛庆善,200     

猪 前 体 脂 肪 细 胞 的 原 代 培 养

建立猪前体脂肪细胞原代培养方法，研究猪脂肪组织增生的生物学特征。选用出生7d的仔猪脂肪组织，采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞，该细胞成分均一、生长旺盛和充脂率高。经形态学动态变化观察、MTT比色法、生长曲线及油红O染色提取法测定，证明是功能活跃的前体脂肪细胞，并在体外重现了其增殖的全过程。     

慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

维甲酸X受体α(RXRα)对猪前体脂肪细胞凋亡的影响

采用semi-qRT-PCR、细胞转染、Hoechst 33342和吖啶橙(AO)荧光染色、流式细胞术等方法,检测体外培养的猪前体脂肪细胞经维甲酸X受体α(RXRα)的配体9顺式维甲酸(9-cis Retinoic acid,9-cisRA)处理、转染增强型绿色荧光蛋R(pEn-hanced green fluorescent proteins C2)-RXRα(pEGFPC2-RXRα)重组质粒和化学合成的RXRa-小分子干扰RNA (small interferingRNA)(RXRα-siRNA)后细胞凋亡的变化.结果表明.猪前体脂肪细胞发牛凋亡的形态学变化为细胞首先体积缩小.细胞浆凝缩,染色质逐渐凝集.细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,胞膜仍完整,然后胞膜小断出芽、脱落.最后细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体;10nmol/L 9-cisRA组与对照组相比,凋亡率显著降低(P相似文献   

猪肌内前体脂肪细胞的体外培养

本研究建立了猪肌内前体脂肪细胞的体外培养模型,以期为更深入研究猪肌内脂肪代谢提供新的实验方法。实验采集出生5d仔猪的背最长肌组织,Ⅱ型胶原酶消化2h后400目筛网过滤,然后1500r/min离心,沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬后差速贴壁2h,弃去原有培养基,加入新的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)进行培养。细胞经传代且完全融合48h后,在完全培养基中添加0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),1μmol/L地塞米松(DEX),10mg/L胰岛素(INS)进行诱导培养48h,再换以含10mg/L胰岛素的完全培养基培养48h,最后换完全培养基继续培养,直至90%的细胞出现脂滴。培养结果:细胞贴壁生长,呈短梭状或棱形,经诱导培养后细胞充脂率高。经形态学观察、生长曲线及油红O脂肪染色法鉴定,证明是肌内前体脂肪细胞。普通PCR及实时荧光定量PCR均检测到了脂联素基因的表达。本研究通过差速贴壁法成功培养了猪肌内前体脂肪细胞,并通过诱导培养重现了其分化、成熟的全过程。     

IGF-Ⅰ、GH和CLA对脂肪前体细胞增殖、分化和基因表达的影响

为探讨类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和共轭亚油酸(CLA)对不同部位来源脂肪前体细胞的增殖和分化程度的影响,以大鼠(Rattus norveaicus)为实验模型,分别从附睾及皮下脂肪组织分离得到脂肪前体细胞,并在不同浓度的IGF-Ⅰ、GH和CLA处理后,用MTT法检测脂肪前体细胞的增殖,用油红O染色法检测脂肪前体细胞的分化聚脂程度。实验结果表明,各剂量IGF-Ⅰ和CLA均能够显著地促进大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化,但GH对大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化均无明显作用。为进一步观察IGF-Ⅰ和CLA对皮下脂肪组织的作用机制,实验采用半定量RT-PCR法检测细胞中PPARγ和C/EBPα基因表达水平,结果发现,100ng/mL IGF-I可显著上调大鼠脂肪前体细胞中PPARγ与C/EBPα基因表达水平;48ng/m LGH和100μmol/L CLA可显著促进PPARγ基因表达,但对C/EBPα mRNA表达无显著影响。结果示IGF-I可能主要通过上调PPARγ与C/EBPα基因的高水平表达进而促进大鼠脂肪前体细胞的分化,而CLA对脂肪前体细胞的作用在上调PPARγ的表达的同时,还作为PPARγ的配体激活该受体而发挥作用。     

超声波处理对文心兰类原球茎增殖及分化的影响

采用不同频率不同时间超声波处理文心兰类原球茎（OLBs）和无菌苗，以探讨适宜的类原球茎增殖、分化及生根条件，结果表明：25kHz超声波处理组PLBs平均增殖率比40kHz超声波处理组高23．4％，其中25kHz超声波处理3min促进PLBs增殖效果较佳，PLBs平均增殖率比对照高49．5％；25kHz超声波处理组PLBs平均分化芽数比40kHz超声波处理组高28．3％，其中25kHz超声波处理6min促进分化效果较佳，平均分化芽数比对照高98．8％，25kHz超声波处理组无菌苗平均根长与平均根数比40kHz处理组高10．1％和13．6％，其中25kHz超声波处理3min促进生根效果较佳，无菌苗平均根长与平均根数比对照组高75．0％和37．5％。     

成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养

建立牛肌内前脂肪细胞体外培养方法，旨在更深入地研究组成肌肉内脂肪组织的肌内前脂肪细胞的增殖分化特性及其影响因素。选取来自成年育肥鲁西黄牛第6与第7肋骨间的肌肉内脂肪组织，利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得牛肌内前脂肪细胞。培养出的细胞成分均一，增殖旺盛，分化率高，经形态学动态变化观察、生长曲线、油红O脂肪染色提取法及对胰岛素和地塞米松反应的测定，证明是功能活跃的前脂肪细胞，并在体外重现了其增殖分化过程，同时经染色体核型分析证明体外培养的细胞倍性正常，可以用于后续研究。本试验成功分离得到了成年育肥牛肌内前脂肪细胞，这为下一步研究肌内脂肪的沉积机制，改善牛肉品质奠定了基础。     

猪卵母细胞在不同条件下的体外成熟培养

研究了不同时间段添加外源激素及不同基础培养液和血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。实验包括（1）猪卵母细胞以TCM199＋10％FBS＋10IU／mL pregnant more serum gonadotrophin（PMSG）＋10IU／mL human chorion gonadotrophin（hCG）＋2．5IU／mL follicle stimulate hormone（FSH）为成熟培养液体外培养44h，前22h在培养液中加激素，后22h不加激素及前22h不加激素，后22h添加激素和添加激素连续培养44h；（2）以实验（1）中激素添加的方案在体外添加激素连续培养44h，对不同基础培养液（TCM199粉剂、TCM199原液和改良TCM199（mM199））对猪卵母细胞体外成熟进行了研究；（3）以实验（2）中筛选出的mM199组为成熟培养液对比血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，实验（1）中3种激素添加不同时间段其成熟率分别为45．67％、45．29％和46．07％，对猪卵母细胞体外成熟无显著影响（P〉0．05）；实验（2）中，mM199组的成熟率（54．10％）高于TCM199粉剂组的成熟率（46．16％）及TCM199原液组的成熟率（47．14％），但差异不显著（P〉0．05）；实验（3）中无血清组的成熟率（67．10％）高于有血清清组的成熟率（52．22％），差异显著（P〈0．05）。由此表明，mM199＋10IU／mL PMSG＋10IU／mL hCG＋2．5IU／mL FSH是一种适合于猪卵母细胞体外成熟的培养液，体外成熟率达67．10％。     

转EGFP基因猪羊水干细胞的体外分化

目的：获得转EGFP基因猪羊水干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能。方法：利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿羊水中分离培养羊水干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果：成功分离培养出羊水干细胞,获得转EGFP基因羊水干细胞,羊水干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。羊水干细胞中β-Actin、NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的羊水干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞（表达LPL和PPARγ-D）、成骨细胞（表达Osteonectin和Osteocalcin）、肌细胞（表达myf-6和myoD）和内皮细胞（表达CD31、CD34、CD144 和eNOS）。结论：从猪胎儿羊水分离羊水干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因羊水干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对羊水干细胞进行标记、追踪。     

小鼠精原细胞体外增殖与冷冻保存

利用一步酶法将7日龄昆白系小鼠睾丸分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞),分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后,系统研究其精原细胞的存活和增殖情况,并对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存,同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻(-196℃)保存。结果表明,小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖,表现为在培养的第1～9天/1～8天呈逐渐减少趋势,第9～13天/8～12天呈增殖趋势,第17天/16天以后增殖减缓,而在KSOM中只短暂存活不能增殖。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1周和2周)冷冻保存及单细胞悬液液氮短期(2周)和中长期(1和3个月)冷冻保存后,均可获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

春兰离体根状茎生长和分化的研究

为优化春兰离体培养条件,以春兰（Cymbidium goeringii）芽诱导的离体根状茎为试材,研究了植物生长调节剂NAA和BA以及有机添加物马铃薯匀浆、番茄匀浆、香蕉泥、蛋白胨和酵母提取物对根状茎生长和新芽增殖的影响。结果表明：从根状茎诱导丛生芽的适宜培养基为1/2MS+0.1mg/LBA+0.5mg/LNAA+1.5g/LAC（活性炭）;根状茎增殖的适宜培养基为1/2MS+0.1mg/LBA+5.0mg/LNAA+1.5g/LAC;除香蕉泥外,其他有机添加物对根状茎生长和增殖均有不同程度的促进作用,但以蛋白胨的效果最佳。     

鸡胚原始生殖细胞体外分化的研究

本文从第19期（孵化68~72h）鸡（Gallus domesticus）生殖嵴分离到原始生殖细胞（PGC），通过PGC-体细胞共培养进行了原代和传代培养，并对PGC做了c-kit免疫组化鉴定。通过改变PGC的体外培养条件，诱导PGC分化成了神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞，并分别通过神经元特异性烯醇化酶（NSE）和角蛋白（keratin）免疫组化进行了分化细胞的鉴定，均呈阳性。结果表明培养的鸡胚PGC在体外可分化成神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。