慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

4个沉默鸡恒定链基因(Ii)慢病毒载体的构建及其效果比较

恒定链(invariant chain,Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用。为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系,本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体,并比较了其干扰效果。首先,用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列,分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7。4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定,分别命名为pLLIi-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539。然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系),进行病毒包装,再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11。结果表明,重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白,用包装的慢病毒接种293T细胞,其滴度达2.2×107~5.1×107TU/mL;接种HD-11细胞的感染率均达到95%以上。最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率,与对照组相比,4个重组慢病毒干扰效率分别为37%、52%、88%和78%;其中,pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高。综上所述,本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体,并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键。实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料。     

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48-72h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法（LaSRT）定病毒滴度。结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×10^8IU／mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。     

PR结构域蛋白1(PRDM1)慢病毒表达载体的构建及其对脐带间充质干细胞(hUC-MSC)向生殖细胞诱导分化的影响

PR结构域蛋白1基因(PR domain containing 1,with ZNF domain,PRDM1)作为原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)形成过程中的一个重要起始因子,在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向PGC的发育分化过程中发挥重要作用。为了研究其在成体干细胞诱导分化中的作用,本研究PCR克隆获得小鼠(Mus musculus)PRDM1基因(GenBank登录号:JX154081.1),构建了PRDM1慢病毒表达载体pCDH-PRDM1,通过293T细胞包装病毒,用携带有PRDM1基因的病毒颗粒转导脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)。结果表明,PRDM1基因成功在hUC-MSC中超表达;PRDM1基因能引起生殖相关基因胚胎特定时期抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)、多能性相关蛋白3(developmental pluripotency associated 3 Dppa3,STELLA)、干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor,C-KIT)和性别决定基因-同源盒2(sex determining region Y-box 2,SOX2)的上调,为进一步研究该基因的功能和提高干细胞向生殖细胞诱导分化研究奠定了一定的基础,并且为hUCMSC向生殖细胞的诱导分化提供了一个新的思路。     

一种制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体的构建

本文构建了一种用于制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体，这种载体含有牛αｓ１－酪蛋白基因的表达调控序列，在５′和３′调控区之间，存在多克隆位点，便于各种不同外源目的基因的插入，两侧存在罕见的单一酶切点，从而可以构建成为理想的转基因结构。     

传染性胃肠炎病毒(TGEV)双启动子真核表达载体pVAXD-N/S的构建与鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触性传染病.TGEV的S、N基因具有重要的免疫学功能,构建S、N双基因疫苗将能提供更好的免疫效果.本研究用RT-PCR扩增S基因抗原区(2.1 kb,含A、B、C和D完整的抗原位点)和N基因编码区(1.2 kb),分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点(MCS),构建了单价质粒pVAXD-N和pVAXD-S,然后将N基因插入pVAXD-S中,构建了双启动子真核表达质粒pVAXD-N/S.将pVAXD-N/S与对照组(pVAXD-N、pVAXD-S和pVAXD)转染COS-7细胞进行表达鉴定,用RT-PCR可从pVAXD-N/S转染细胞中扩增出s、N两个目的基因,IFA鉴定结果显示,pvAXD-N/S可同时表达S、N两种目的蛋白.初步的小鼠(Mus musculus)免疫试验结果显示,pVAXD-N/S免疫小鼠后第14天即可检测到抗TGEV的IgG抗体,第35天抗体达最高峰,pVAXD-N/S诱导的抗体水平显著高于单基因质粒组pVAXD-N和pVAXD-S的抗体水平(P＞0.5),与混合质粒(pVAXD-N+pVAXD-S)诱导的抗体水平相当.本研究结果表明,构建的双启动子表达载体pV AXD-N/S具有S、N基因的双重免疫功能,为TGEV新型双基因疫苗研究提供了基础材料.     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

节粮小型蛋鸡的选育

本研究成功地将来源于进口肉鸡品系的dw基因导入到高产褐壳蛋鸡，选育出矮小型褐壳蛋鸡纯系：在此基础上，在国际上首先推出节粮小型褐壳蛋鸡配套系，即用矮小型褐壳蛋鸡公鸡(快羽)和农大褐DC母鸡(慢羽)杂交，形成三系配套的矮小型褐壳蛋鸡商品代——农大褐3号。同时，还对小型褐壳蛋鸡的营养需要、饲料配方、饲养条件等配套     

油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

一种简单有效的提取马铃薯块茎总RNA方法

对于块根、块茎和果实等富含淀粉、多糖的特殊材料,应用常规方法提取RNA,存在产量低、淀粉和多糖污染严重等问题（Logemann et al.,1987）.本研究采用马铃薯块茎为材料,通过改进变性液和抑制多酚氧化等环节,建立了一个改良的RNA抽提方法,有效的解决了在马铃薯块茎总RNA抽提过程中多糖污染和酚氧化等问题.……     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。     

一种通用型土壤有效元素高效提取方法及应用

Mehlich 3（M3）方法可同时提取土壤中磷、钾、钙、镁、铝、铁、锌、锰、铜等多种元素的有效态，提高土壤检测的效率；另外，M3法适用于钙质土、火山灰土、高度风化土等各类土壤，可作为一个“通用”型土壤有效元素提取试剂。但是硝酸铵（NH4NO3）由于管制不易获取，应用M3方法测定土壤有效元素含量时受到极大限制。因此，本研究用另一种易获取的惰性电解质氯化铵（NH4Cl）替代硝酸铵（NH4NO3），评价氯化铵替代硝酸铵M3法的适用性。Pearson相关分析结果表明，用氯化铵替代硝酸铵M3法测得的30种土壤有效磷、钾含量与M3法测定结果呈极显著正相关，其决定系数（R2）分别为0.99（P=2.31×10-55，n=60）和0.98（P=1.52×10-49，n=60）。同时，氯化铵替代硝酸铵M3法和M3法测定的有效钙、镁、铝、铁、锌、锰和铜含量极显著相关，R2值分别为0.98，1.00， 0.99，0.96，0.99，0.95和0.94。氯化铵替代硝酸铵M3–P与酸性、中性和碱性土壤的 Bray–P和Olsen–P极显著相关，R2分别为0.97和0.91 （P=1.42×10-15和1.00×10-21，n=20和40）。同时，利用氯化铵替代硝酸铵M3法测定酸性改良土壤有效磷含量，发现其得到显著提高。因此，氯化铵替代硝酸铵M3法可作为测定各种土壤，以及改良土壤中有效磷、钾和其他金属元素有效态含量的通用方法。     

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。