瓜类细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其对致病性的影响

瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜和甜瓜上危害最为严重的病害之一,目前除了严格的检疫措施之外,尚无十分有效的控制措施。随着细菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统的发现和研究进展,利用“信号干扰技术”控制植物细菌病害已经成为研究热点并取得了成功应用。本文利用生物测定技术首次从瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）检测到群体感应信号分子（AHL）,并将能够降解细菌信号分子的aiiA基因转化到瓜类细菌性果斑病菌NJF10菌株中,室内接种试验表明该转化菌株的致病性明显的减弱,证明其对果斑病菌的致病性具有调控作用。研究结果为利用信号干扰技术控制瓜类细菌性果斑病奠定了基础。     

瓜类细菌性果斑病菌hpaP基因的功能分析

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用.     

瓜类细菌性果斑病菌过敏性反应和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response,HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了其突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性;hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱;进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性...     

梨火疫病菌分子检测新靶标——EAsdiA基因的克隆与应用

SdiA属于与群体效应相关的luxR家族基因，目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌中克隆到了一个sdiA的同源基因，命名为EAsdiA，该基因与Es. coli和S. typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性，与其他细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了一对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR，该引物能够特异地检测梨火疫病菌，检测灵敏度为 10个菌体，在含有梨组织浸出液的情况下可检测到102个菌体。本研究是首次从梨火疫病菌中克隆SdiA基因并应用于该病菌分子检测的报道。     

梨火疫病菌luxR转录调节因子的克隆与功能分析

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)是一种具有毁灭性的植物病原细菌,能够侵染梨、苹果和其他蔷薇科植物引起火疫病,造成严重的经济损失。luxR家族调控因子具有重要的生理生化作用,是细菌群体感应机制中研究较多的一类重要的转录调节基因。本研究采用PCR技术从梨火疫病菌中扩增出一个luxR同源基因,命名为EaluxR,应用同源重组的方法构建了突变株(EaΔluxR),并对其功能进行初步研究。实验结果表明,EaΔluxR与野生型菌株相比产生的多烯大环内酯类代谢产物在抗氧化压力和生长情况方面有明显差异,对梨幼苗及幼果的致病能力下降;但是EaΔluxR仍能引起烟草过敏性反应,并且在抗生素耐受水平和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异。研究表明,梨火疫病菌对病菌的生长、次级代谢产物、抗氧化压力以及致病性方面具有关键作用,为深入认识梨火疫的群体感应系统提供了科学依据。     

EAsdiA基因的克隆和作为新靶标对梨火疫病菌的检测

基因sdiA属于与群体效应相关的LuxR家族,目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中克隆到了一个sdiA的同源基因,命名为EAsdiA(GenBank登录号:AY864839),该基因与E.coli和S.typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性,与其它细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了1对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR,能够特异地检测梨火疫病菌,检测灵敏度为10个菌体,在含有梨组织浸出液中可检测到102个菌体。本研究首次从梨火疫病菌中克隆sdiA基因并作为新靶标应用于该病菌分子检测。     

水稻细菌性条斑病菌REC结构域蛋白基因vemRXoc的功能鉴定

水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）是水稻的主要病原细菌之一,该菌引起的水稻细菌性条斑病可导致水稻减产、品质下降。Xoc GX01菌株基因组中含有一个与十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）的致病相关基因vemR一致性高达95.27%的同源基因XOC2152,其编码蛋白中含有磷酸信号识别受体REC结构域。为了研究XOC2152基因在Xoc中的生物学功能,本研究通过基于自杀质粒pK18mob同源整合方法,构建了XOC2152的非极性突变体NK2152。该突变体的胞外多糖产量仅为野生菌株的27.33%,平板游动半径为野生菌株的40.96%,对铜离子耐受能力极显著降低。针刺接种水稻（日本晴品种）10d后,Xoc GX01处理的病斑平均长度为（3.86±1.19）cm,而突变体NK2152处理的病斑长度为（0.98±0.45）cm。带有该基因片段的pLAFR3可以互补突变体的表型和致病力变化。上述结果表明XOC2152基因具有与Xcc的vemR类似的功能,被命名为vemRXoc基因。本研究表明XOC2152基因（vemRXoc基因）与水稻细菌性条斑病菌的致病力、胞外多糖产量、运动能力以及对铜离子的耐性等相关。     

免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病研究

利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立了免疫捕捉PCR检测西瓜果斑病菌的检测法，并与直接PCR和生长检测法作了比较。结果表明，所测果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli都产生360bp左右的特异性片段，而10个不同属的对照菌株无特异性片段产生。免疫捕捉PCR检测果斑病菌的灵敏度为50-102cfu/ml，而直接PCR则在104cfu/ml，两者的灵敏度相差100倍左右。免疫捕捉PCR法对市售7种瓜种的检测发现，其中1种哈密瓜种子、2种甜瓜种子和2种西瓜种子检出果斑病菌，与人工气候箱内生长检测的发病结果基本吻合。显示了该法准确、灵敏、快速、低成本等优点。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

玉米内生芽胞杆菌的抗菌活性物质及其拮抗玉米大斑病菌机理的初步研究

为了研究生防菌株对玉米大斑病菌的抑菌作用,深化对生防菌抗菌机制的认识,本研究从玉米(Zea mays)植株体内分离拮抗玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的内生细菌,对其抗菌物质及其抑菌机理进行初步研究。结果表明,所分离的内生菌株YY1经形态学观察、生理生化测定及16SrDNA序列分析,鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。菌株YY1发酵液的硫酸铵沉淀物具有抑菌活性,且在硫酸铵50%饱和度时抑菌活性最强,说明YY1菌株产生的抗菌活性物质可能是蛋白类物质。该菌株及其蛋白粗提液均对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)等7种植物病原真菌有较强的拮抗作用。用蛋白粗提液处理菌丝、分生孢子、原生质体后经显微观察发现,大斑病菌的基内菌丝由丝状畸变为串珠状,当蛋白粗提液浓度为0.78μg/μL时,可完全抑制分生孢子萌发,并导致原生质体裂解。通过抑制孢子萌发过程中信号途径相关基因的半定量RT-PCR分析和玉米大斑病菌不同信号途径相关基因突变体的抑制率统计,初步判定该抑菌过程主要通过cAMP信号转导途径发挥作用。本研究为寻找玉米大斑病菌新的防治方法和途径提供基础资料。     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

秋茄KcRD22基因的克隆与功能分析

本文以用200mmol／LNaCl处理24h后的秋茄幼苗为材料提取秋茄叶片总RNA,利用RT-PCR方法克隆获得KcRD22基因的全长cDNA,通过构建pCAMBIA-2300-KcRD22过表达载体,利用农杆菌侵染的方式获得过表达KcRD22的烟草转基因株系,并对转基因株系的耐盐性做出初步分析。实验结果显示：KcRD22基因的ORF长1131bD,编码1个等电点为9．07、分子量为39．8kD、由375个氨基酸组成的蛋白。PCR及RT—PCR鉴定结果表明,KcRD22基因已经分别整合到8株烟草的染色体中,并在两个株系中获得表达。对转基因烟草进行光合作用测定,结果显示100mmol／LNaC1处理显著降低了野生型烟草的净光合速率,而转基因植株叶片的光合作用受到的影响较小。盐浓度达到200mmol／L时,转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低,但盐胁迫解除后,转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草,说明KcRD22的过表达提高了烟草的抗盐性。本文初步确定了KcRD22基因对植物耐盐性的贡献,这为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的功能奠定了良好基础。     

雷竹SEP-like基因的克隆及功能分析

为探究竹类植物中SEP-like基因的功能,利用同源克隆方法从雷竹中克隆出1个SEP-like基因,命名为Pv MADS5。该基因的开放阅读框为687bp,可编码228个氨基酸。同源比对与系统进化树分析表明,该蛋白与箭竹、毛竹、麻竹SEP类蛋白同源,同属于禾本科Os MADS5亚类。实时荧光定量PCR结果表明,Pv MADS5在开花和不开花雷竹中的幼叶、老叶、秆、竹笋及花中均有表达;亚细胞定位表明Pv MADS5是核蛋白。在拟南芥中过表达Pv MADS5,转基因植株比野生型开花晚并且莲座叶变小,表明Pv MADS5可能是开花抑制基因且参与叶的发育。本研究为揭示竹子开花的分子机制提供了理论依据。     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

不结球白菜BrABF1基因的克隆与功能分析

为研究BrABF1基因在不结球白菜中的表达模式并探索其在开花调控中的作用,本研究以不结球白菜苏州青品种为试验材料,通过同源克隆获得BrABF1基因序列,对其氨基酸序列进行比对和进化分析,利用亚细胞定位技术研究BrABF1的空间表达,采用β-D-葡糖醛酸酶(GUS)染色方法研究BrABF1在植物中的表达模式,利用PlantCARE在线软件预测BrABF1基因的启动子的顺式作用元件。构建植物表达载体pEarlyGate101-BrABF1-YFP转化拟南芥,统计野生型和转基因拟南芥植株的开花时间。结果表明,BrABF1基因含有1 104 bp开放阅读框(ORF),编码367个氨基酸。BrABF1与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,进化关系最近。BrABF1定位在细胞核上。BrABF1启动子驱动的GUS蛋白主要在拟南芥的叶脉中特异性表达。BrABF1启动子序列包含大量的顺式作用元件,如光响应元件、植物激素响应元件、低温响应元件和逆境胁迫响应元件等。转基因拟南芥植株开花时间晚于野生型,表明BrABF1基因能抑制植物的开花。本研究结果为提高不结球白菜商品价值提供了理论基础。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.