转基因玉米NK603基体标准物质研制

由于转基因标准物质的缺乏,无法保证检测结果的准确、可靠和可比。本研究将筛选后的转基因玉米(Zea mays)NK603 阳性材料及受体进行研磨筛分,粒径测定结果表明,研磨后的粒径大小为 100 μm左右。采用重量法配置了 3 个不同水平的转基因玉米基体物质,应用实时荧光定量 PCR 方法对研制的标准物质进行均匀性和稳定性检测,统计结果表明,所研制的基体标准物质均匀性良好;在 4 ℃保存条件下,一年内未发现不稳定现象。重量法确定的标准值和扩展不确定度(k=2)分别为(0.50±0.10)%、(1.00±0.35)%和(5.00±0.35)%。同时选择 7 家实验室进行协同验证,结果表明,研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质量值准确可靠,与国外标准物质相比,不确定度水平相当。本实验研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质适用于转基因玉米 NK603 的定量检测。     

转基因植物标准物质研究进展

转基因产品的安全性一直都备受关注,因此转基因产品的定性、定量检测越来越重要,而转基因标准物质的使用是转基因产品检测结果有效和可比的重要保证.本文针对国内外转基因植物标准物质的研究现状及相关技术进行综述,重点介绍了转基因植物标准物质的种类、转基因标准物质定值技术,分析了转基因标准物质研制过程中的关键点.更重要的是综述并提出了质粒DNA分子标准物质的定值模式,包括如何合理评价质粒分子可替代性问题,此外还总结了目前国外转基因标准物质的种类,目的是为我国转基因植物标准物质研制和相关研究提供有价值的参考.     

转基因技术在玉米育种中的应用

介绍了应用转基因技术在改善玉米抗性方面培育出了抗虫、抗除草剂及抗病毒的转基因玉米,并提出转基因技术还用于改良玉米的品质。在基因转化途径方面主要分析了农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道等技术。     

转基因大豆MON89788基体标准物质的研制

转基因产品成分检测是转基因生物安全管理和标识的重要支撑,而转基因生物标准物质是获得准确、可靠、具有可比性检测结果的保证.转基因大豆(Glycine max) MON89788为我国批准进口用作加工原料的农业转基因生物,因此,制备转基因大豆MON89788基体标准物质是对其进行安全管理所必需的.本研究通过将转基因大豆MON89788和其受体材料A3244分别冷冻研磨成粉末,按质量分数称量配制,得到转基因含量为49.3 g/kg的标准物质.采用方差分析法(F检验法)进行均匀性检验,统计量F值为1.618,小于临界值F(0.05,11,24)标准物质均匀性良好;短期稳定性考察结果表明,标准物质可在常温下稳定储存4周,在-20℃下长期稳定性达到30个月.本批MON89788基体标准物质有两个特性量值,一是基于重量法配比混合的粉末质量分数,量值为49.3 g/kg,扩展不确定度为2.0 g/kg;二是基于qRT-PCR 8家实验室联合定值的转基因DNA与总DNA的质量分数,量值为49.8 ng/μg,扩展不确定度为5.9 ng/μg.本批标准物质每瓶1.0 g,使用时最小取样量为100mg,可用于对转基因大豆MON89788进行定性和定量检测,以及转基因大豆MON89788特异性检测方法的评价和实验室质量控制.本研究为我国转基因检测基体标准物质的研制提供了理论基础和技术支持.     

水稻淀粉分支酶基因(RBE4)作为转基因水稻基体标准物质的内标准基因的研究

内标准基因(endogenous reference gene)是指具有物种专一性、不显示等位基因变化、拷贝数恒定的保守DNA序列,对基因定量分析时具有重要意义.本研究选取了5个水稻内标准基因:根部表达的水稻基因(rice root-specific,GOS9)、磷脂酶D基因(phospholipase D,PLD)、蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase,SPS)、水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)、泛素蛋白基因(ubiquitin 5,UBQ5)和2个外源基因:苏云金芽孢杆菌CrylAb杀虫晶体蛋白基因CrylAb和cryl Ab/cryl Ac融合杀虫晶体蛋白基因(CrylA c/CrylAb),分别以转基因水稻(Oryza sativa L.)克螟稻2号和TT51-1为模板,比较各自的外源基因(CrylAb =KMD2和CrylA c/CrylA b=TT51-1)与5个内源基因的PCR产物量,筛选出和外源基因PCR产物量最接近的内标准基因为RBE4.在此基础上,数字PCR不依赖于已知浓度的标准曲线来定值,可以避免标准样品的标准曲线和样品目的基因的扩增曲线在扩增效率上的不一致等因素所带来的误差,定值结果更加准确、可靠,采用数字PCR分析外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值,荧光定量PCR方法分析内标准基因RBE4和外源基因的定量检测稳定性、灵敏度等.结果表明,外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值在转基因水稻克螟稻2号和TT51-1上都较接近于1∶1,分别为115.9％和105.3％.RBE4的荧光定量PCR体系重复性、定量检测稳定性和灵敏度好,符合作为转基因水稻基体标准物质定量分析的内标准基因的要求,RBE4定量体系在TT51-1和克螟稻2号的最小检出限(LOD)分别为5～11 copies/μL和3～12 copies/μL,最小定量限(LOQ)分别为11～22和12～24 copies/μL.RBE4是转基因水稻标准物质研制和产品定量检测的适宜内标准基因.研究结果为转基因作物标准物质研制和定量检测的内标准基因选取提供一定的参考.     

SSR分子标记与玉米杂种优势关系的研究

选择较为均匀地分布于玉米（Zea mays)10对染色体上的71对SSR引物，在17个自交系间共检测出384个等位基因变异，每对引物检出2－12个等位基因，平均为5．4个，每个SSR位点的多态信息量（PIC）变化于0．278－0．896之间，平均为0．672。利用384个多态性SSR标记位点计算了17个自交系之间的遗传相似系数（GS），其范围在0．681－0．873之间，平均为0．740。以SSR标记遗传相似系为原始数据，按UPGMA方法对17个自交系进行聚类分析，以相似系数0．750为标准，可将17个自交系分为6类，聚类结果和已知系谱关系十分吻合。根据直线相关分析，自交系间SSR分子标记遗传距离与产量及杂种优质相关极显著，但相关系数较小，分别为0．443和0．310。分群后进行的相关分析表明，遗传距离与产量以及遗传距离与杂种优势的相关系数分别提高到0．682和0．609，均达到极显著水平。因此，合理分类，并选择合适的自交系配制组合，可避免群内自交系间杂交，减少育种的盲目性和工作量。     

农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究

研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明,同一基因型玉米自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组织生长速度快,转化效率高;高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长,致使部分转基因愈伤不能分化成苗,并提出其解决途径。     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

转基因玉米抗性愈伤再生植株的影响因素研究

再生植株的培养是玉米转基因重要环节之一.本文比较了基本培养基、愈伤组织大小、继代次数、激素添加物对转基因抗性愈伤组织分化和再生植株的影响.结果表明:以N6为基本培养基有利于抗性愈伤组织分化;抗性愈伤组织大小在2.5 ～3.5mm之间、继代2～3次的分化率最高;再生培养基中添加ABT 0.5 mg·L-和S3307 0.25 mg·L-1能促进生根壮苗.本研究为转基因玉米再生体系建立提供了依据.     

转基因抗矮花叶病玉米及其亲本生理特性的对比研究

为了探明转基因玉米的生理特性,本文研究了转基因抗矮花叶病玉米和亲本玉米(非转基因玉米)的发芽能力及苗期第1真叶的叶绿素含量和淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及3种保护酶同工酶的酶谱。转基因玉米与非转基因玉米的发芽能力差异不显著,叶绿素a和叶绿素a+b含量显著高于非转基因玉米。转基因玉米淀粉酶活性和蛋白酶活性显著高于非转基因玉米。转基因玉米与非转基因玉米胚芽中POD、CAT和SOD酶活力均无显著性差异,转基因玉米第1真叶中3种保护酶活性显著高于非转基因玉米。转基因玉米和非转基因玉米胚芽中检测到POD的3种同工酶POD-1、POD-3和POD-4,非转基因玉米第1真叶中检测到4种同工酶POD-1、POD-2、POD-3和POD-4;转基因玉米第1真叶还含有POD-5。转基因玉米和非转基因玉米胚芽和第1真叶中都有4种CAT同工酶CAT-1、CAT-2、CAT-3和CAT-4。转基因玉米和非转基因玉米胚芽中的SOD共有两种同工酶,分别为SOD-1和SOD-2;转基因玉米和非转基因玉米第1真叶中共检测到7种SOD同工酶,分别为SOD-1、SOD-2、SOD-3、SOD-4、SOD-5、SOD-6和SOD-7。综上所述,转基因抗矮花叶病玉米发芽能力及胚芽中保护酶活性与非转基因玉米无显著差异,转基因玉米第1真叶中3种保护酶活性显著高于非转基因玉米。     

玉米自交系鲁原92的选育及应用

利用辐照技术与常规方法相结合选育出的鲁原92玉米自交系具有配合力高、抗逆性强、自身产量高、综合农艺性状好的优点,成为我国当前重要的骨干自交系之一,国内育种单位直接或间接利用该系已育成通过国家和省级审定的品种19个。据有关省级种子管理部门的不完全统计,利用该系组配成的品种在生产上累计推广面积达520万hm2,创造社会经济效益18.82亿元。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建及其表达

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素(myostatin)N端基因片段(MSTN)和抑制素(inhibin)N端基因片段(INH)分别插入S基因编码的C端和第112～113氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI.酶切和测序鉴定表明.重组质粒pVAX-SMI构建成功.脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western blot检测重组蛋白的表达,结果表明,重组蛋白成功在HeLa细胞中表达.     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达质粒(pGM-CSF/SS)的构建及其对小鼠的免疫

从猪真核表达质粒pGM-CSF通过PCR扩增出猪GM-CSF基因的编码序列,将GM-CSF基因亚克隆到生长抑素真核表达质粒pcS/2SS中,构建GM-CSF与生长抑素(SS)的融合表达质粒pGM-CSF/SS,酶切鉴定和DNA测序证实重组的融合表达质粒pGM-CSF/SS构建正确。选择30只小鼠,随机分为三组,其中1组为对照组,2组和3组分别肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS,研究pGM-CSF/SS对小鼠的免疫效果。结果表明：GM-CSF可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力,以pGM-CSF/SS组增殖能力最强,分别比对照组和pcS/2SS提高8.4%（P＜0.05）。肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS免疫小鼠均能有效激发免疫系统,产生较强的免疫应答,与对照组相比,生长抑素抗体P/N值都有所提高,且随着免疫时间的延长,呈现不断增高的趋势;pGM-CSF/SS组P/N在试验的各个时期均高于pcS/2SS组。阳性鼠的比例以肌注pGM-CSF/SS为最高,达60%,pcS/2SS肌注组为30%,对照组没有出现阳性鼠;这些结果证明,GM-CSF对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,为研究GM-CSF基因对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用提供了理论基础。     

农杆菌介导的玉米遗传转化研究进展

农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。目前,模式玉米种质幼胚的转化体系已程式化,且开发了新筛选基因和获得不含筛选基因转基因玉米的方法,但是大多数育种骨干自交系转化频率低和转化受体基本上是幼胚。从农杆菌、受体及培养条件多方面各种因素对问题进行分析,多数研究认为针对特定基因型和受体材料建立好的受体再生系统,结合高效率农杆菌转化体系,获得多目的基因聚合（无其它外源片段）的转基因玉米将是农杆菌介导玉米转化体系研究的最终目标。本文主要从农杆菌介导（转基因）法应用于玉米遗传转化的历史、现状、问题等方面进行综述,为同领域的研究者提供一定的参考。     

PRK基因原核表达质粒的构建

以拟南芥cDNA为模板,扩增出PRK基因,构建重组质粒pET-28a(+)-PRK转化大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌表达载体BL21中,构建PRK基因原核表达载体。测序结果表明pET-28a(+)-PRK载体构建成功。     

转基因玉米LY038转化事件的特异性检测

转基因高赖氨酸玉米LY038在畜禽饲料中已得到广泛应用,但目前还没有关于其侧翼序列扩增及转化事件特异性定性PCR检测方法方面的报道.本研究采用修饰接头连接PCR(modified adapter-linked PCR,M-AL-PCR)技术获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5′端侧翼序列.据此侧翼 序列设计其转化事件特异性引物,建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法,扩增片段175bp.以转基因玉米(Zea mays L.)LY038、MIR604、Bt176、Bt11、MON810、MON863、GA21、NK603、非转基因玉米、转基因水稻(Oryza sativa L.)Cry1C*、Cry2A*、转基因大豆(Glycine max)Roundup Ready和转基因油菜(Brassica campestris L.)GT73为材料,验证该方法具有高特异性及灵敏度,最低检测限约为0.1%.研究结果提示,该定性检测体系可准确、快速、高效的检测转基因玉米LY038及其产品.