植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本0293中的遗传转化

以超级杂交稻父本0293为材料,利用农杆菌介导基因转化法研究植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本中的遗传转化。结果表明:0293成熟胚愈伤组织的最适诱导培养基为NMB诱导培养基,2,4–D和6–BA的最适质量浓度分别为3.0和0.2 mg/L;以LB液体培养的农杆菌转化能力最强,抽真空转化方式获得的抗性愈伤率较高,最适共培养时间为2 d;麦芽糖为抗性愈伤组织分化的最适碳源,NMB+KT 0.4 mg/L+6–BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L为较适合的分化培养基;通过优化农杆菌介导的遗传转化条件,共获得6株含目的基因snc1的转化植株。     

抗逆转基因旱稻转化体系的优化

以粳糯型常规旱稻品种"冀旱糯3号"为受体材料,利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入旱稻细胞,建立了适用于旱稻的高效转化体系,最终获得转基因植株,并对转基因植株进行PCR检测。结果表明:当农杆菌浓度(以D_(600 nm)表示)为0.2时,转化效果最好。在筛选抗性愈伤时,除草剂的最佳浓度为40 mg/L,对抗性愈伤组织进行预分化能提高其分化率,对转基因植株进行分子检测,优化后的转化率提高到37.5%。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

小麦幼胚愈伤组织的遗传转化

将从水稻中提取的抗性调节转录因子OsDREB2.2基因,通过农杆菌介导进入小麦组织细胞内的方法,培育筛选稳定遗传的植株,使小麦中的一系列抗性基因得以表达,从而培育出抗逆性强的小麦新品种。采用河北农业大学自主培育的小麦新品种河农825、河农827、河农831等为试验材料,以各自幼胚为外植体,诱导的愈伤侵染农杆菌后,获得的抗性愈伤组织数平均为170.44、分化愈伤数平均为24.56、抗性芽与转化幼胚总数的比例平均为0.96%。表明本研究中采用的愈伤组织诱导、农杆菌侵染和植株再生条件是适宜的。     

农杆菌介导CBF1基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础。[方法]利用农杆菌介导CBF1基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时间对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响。[结果]以重组质粒pBI121-CBF1为模板,利用CBF1cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650bp的片段,表明重组质粒构建成功。在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡。用100μmol/LAS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高。农杆菌侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响。[结论]当AS浓度为100μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%。     

籼稻品种Kasalath遗传转化条件研究（摘要）

[目的]探索籼稻品种Kasalath的遗传转化条件,为针对该品种进一步的分子生物学研究奠定基础。[方法]以籼稻品种Kasalath的愈伤组织为转化受体,应用根癌农杆菌介导法进行遗传转化;从共培养方式、共培养时间、共培养后处理方法等方面优化遗传转化体系。①共培养条件的优化：愈伤组织接入共培养基时分2组,1组加1层灭菌滤纸,1组不加。②共培养时间的优化：分别于农杆菌液侵染愈伤1,2,3,4 d观察。③共培养后处理方式的优化：方式1,将共培养后的愈伤组织用灭菌蒸馏水冲洗多次至水清亮无混浊悬浮物,然后用含有羧苄青霉素的灭菌蒸馏水浸泡30 min,放置在有3层滤纸的灭菌培养皿中短暂干燥。方式2,将共培养后的愈伤组织置于带2层滤纸的灭菌培养皿中干燥,干燥3 d后取出。2种方式干燥后的愈伤组织均接入含40 mg/L潮霉素筛选压的筛选培养基上,筛选2次,每次2～3周。[结果]Kasalath的愈伤组织经农杆菌侵染后,经过共培养,再经筛选培养出抗性愈伤直至分化成转化苗,共培养时问对于转化效率的影响较大。如果共培养时间过长,将导致农杆菌过度生长,随后的筛选培养中即使加入抗菌的羧苄青霉素也无法抑制其生长,愈伤组织褐化死亡率增大。而共培养时间太短,则影响农杆菌Ti质粒T-DNA的转移,影响转化效率。该研究中当愈伤组织与农杆菌共培养时间为2 d时的转化效果最好,抗性愈伤组织获得率达84.1%,转化菌的转化率达到73%,且共培养时愈伤组织是否直接接触培养基对转化无明显影响。利用PMCG161载体引物PMCGF和PMCGR对所获得的部分转化苗进行PCR检测,23株转化苗中有13株扩出了预期的约750 bp条带,且为阳性转化苗,表明外源基因OsMAPK2已整合到水稻品种Kasalath的基因组中。[结论]经愈伤组织的诱导、共培养、筛选、预分化、分化等步骤,最终成功实现了农杆菌介导的OsMAPK2基因对籼稻品种Kasalath的遗传转化。     

粳型恢复系C418转基因再生体系的建立

为水稻转基因育种和突变体库的建立创造有利条件,以粳稻C418成熟胚为外植体,通过植物组织培养技术,考察不同基础培养基(N6、MS、MSN、NMB、NB、MB和NBD)和生长素2,4-D浓度(1mg/L、2mg/L和3mg/L)对外植体愈伤组织诱导效果;将继代培养获得的优良愈伤组织采用农杆菌介导法进行遗传转化,并考察适宜的共培养时间以及不同抗生素(头孢霉素、氨苄霉素和m潮霉素)对愈伤组织的分化效果,以建立北方骨干粳型恢复系C418转基因再生体系。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,基础培养基NBD+3mg/L 2,4-D处理粳稻C418成熟胚愈伤组织诱导率最高,达90.38%,愈伤组织生长状态最佳;水稻愈伤组织共培养2d获得的抗性愈伤组织最多,筛选培养基中降低头孢霉素浓度并添加氨苄霉素可提高水稻愈伤组织分化率。通过培养基类型、激素浓度、共培养时间及抗生素种类的最佳组合,成功建立北方骨干粳型恢复系C418转基因再生体系,即水稻外植体经次氯酸钠处理后接种于诱导培养基NBD+3mg/L 2,4-D,获得愈伤组织,再用农杆菌悬浮液(含目的基因)侵染愈伤组织,最后获得含目的基因的转基因植株。     

抗蚜基因PPA遗传转化‘鲲旱2号’的研究

以‘鲲旱2号’成熟胚为外植体,通过农杆菌介导法将抗虫基因PPA导入旱稻愈伤组织中,以期获得抗虫转基因旱稻植株。对影响愈伤组织诱导效果的2,4-D浓度进行了研究。结果表明:当2,4-D浓度为2mg/L时,愈伤组织诱导效果最佳。对获得的转化植株进行PCR检测证明PPA基因已成功整合到旱稻基因组DNA。对阳性植株的后代喷施0.8mg/mL除草剂检测表明,转基因植株后代具有良好的除草剂抗性。     

低酚棉胚性愈伤组织农杆菌转化体系建立及转DREB1C植株的获得

利用农杆菌介导法对低酚棉胚性愈伤组织转化转录因子DREB1C基因,探讨了低酚棉胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性和胚性愈伤组织状态对转化效率的影响。结果表明：胚性愈伤组织对潮霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为25mg／L,可明显抑制非转化组织生长。以继代培养7～14d的胚性愈伤组织作为转化受体,转化率高达56．3％。将转化后获得的抗性愈伤组织转入分化培养基中分化成苗,经过PCR检测得到5株阳性植株。     

反义Waxy基因转化籼稻9311的初步研究

以籼稻品种9311为材料,研究了不同诱导培养基对籼稻9311的诱导率,以及农杆菌浓度、浸染时间和干燥处理时间对抗性愈伤率的影响,进而采用农杆菌介导的共转化方法将含有反义Waxy基因的p13W8质粒和含有潮霉素抗性标记基因的p1300质粒同时转化受体材料.结果表明:籼稻9311成熟胚在含质量浓度为3.0 mg/L的2,4-D的N6基本培养基上具有较高的愈伤组织诱导率,且愈伤的胚性性状良好;愈伤组织在OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染10 min、干燥1.5～2.0 h处理后能够获得较多的抗性愈伤组织;对转化水稻的再生植株进行PCR检测表明,反义Waxy基因已整合进T0代水稻基因组中.     

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系.转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2~6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg@L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg@L-1潮霉素筛选10~15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98%,并且能够周年转化.     

农杆菌介导CBFl基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础.[方法]利用农杆菌介导CBFl基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时问对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响.[结果]以重组质粒pBI121-CBFl为模板,利用CBFl cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650 bp的片段,表明重组质粒构建成功.在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡.用100 μmol/L AS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高.农杆茵侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响.[结论]当AS浓度为100 μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%.     

根癌农杆菌介导获得粳稻转基因植株

以水稻粳稻品种空育131、垦鉴稻6号、垦鉴稻7号为材料,用根癌农杆菌感染成熟胚诱导的愈伤组织,将反义蜡质基因导入受体材料。经两次抗性筛选后,转入分化培养基中分化培养后获得转基因小苗。将转化植株进行GUS染色、PCR鉴定,能证明外源目的基因已经整合到植株中。     

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

宁夏水稻农杆菌转化组培体系的建立

高效的组培再生体系是水稻农杆茵遗传转化的基础,以宁夏4个主栽水稻品种为受体材料,对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的几个主要因素进行了研究,结果表明:花药和幼胚的愈伤组织诱导率高于成熟胚,而且愈伤状态好,有利于转化;在共培养基上铺上1张灭菌滤纸共培养时,农杆茵在培养基及受体材料表面上不会过度生长.共培养条件以26℃,共培养2天的抗性愈伤频率最高;共培养后不经洗茵处理直接进行筛选的抗性愈伤频率高于洗茵处理;经过预分化培养可提高分化率;干燥处理不仅可以有效杀死农杆茵,而且可以改善愈伤组织状态,提高转化率.初步建立了宁夏几个主栽品种的农杆菌转化体系.     

藜麦愈伤组织诱导和分化条件初探

[目的]探索藜麦愈伤组织诱导和分化条件,为建立其遗传转化体系提供参考.[方法]以下胚轴为外植体进行根癌农杆菌侵染,在诱导阶段分别比较品种、光照、培养基碳源和外源基因对藜麦愈伤组织诱导的影响;在分化阶段分别比较培养基中KNO3和6-BA浓度对愈伤组织分化的影响.[结果]从18个藜麦品种中筛选出9个较易诱导出愈伤组织的品种...     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

农杆菌介导法获得匍匐翦股颖转GO基因植株

以匍匐翦股颖2个品种Pent A-4和L-93的成熟种子为外植体材料,附加2,4-D 4.0 mg/L和KT 0.05 mg/L的稍作修改的MS培养基为愈伤组织诱导和继代培养基.琼脂条的用量为16 g/L时,50%以上的愈伤组织呈浅黄色或白色、干燥、颗粒状结构.颗粒状愈伤组织经过连续3次继代培养后,其绿苗分化率保持在60%以上.以颗粒状胚性愈伤组织为受体材料,用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶(GO)基因和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)的重组质粒导入匍匐翦股颖.愈伤组织经农杆菌LBA4404/pBGO感染和共培养后,在附加G-418 60 mg/L的愈伤组织继代培养基上选择到具有卡那霉素抗性的愈伤组织.抗性愈伤组织分化的绿苗在附加G-418 30 mg/L的绿苗分化培养基上进行筛选,获得了抗性再生植株.试管植株的叶片经淀粉-碘化钾显色反应,检测到转GO基因植株产生的过氧化氢.PCR分子检测结果证明,GO基因已整合到转化植株的基因组中.抗病性鉴定结果显示,转GO基因植株抗水稻纹枯病.