副溶血性弧菌7种保藏方法比较

采用7种不同方法对副溶血性弧菌的保藏效果进行研究,以菌种的保藏时间、存活率、生物学特性及毒力指标比较保藏效果.结果表明:保藏时间由长到短依次为:冷冻真空干燥保藏法＞-20℃脱脂牛奶保藏法＞室温液体石蜡保藏法＞4℃液体石蜡保藏法＞-20℃甘油保藏法＞室温斜面保藏法＞4℃斜面保藏法.7种方法保藏前后,副溶血性弧菌革兰氏染色,氧化酶,0 NaCl、4％ NaCl及10％ NaCl盐度生长试验,TCBS培养基上生长性状及溶血性试验等基本生物学特性均无影响.冷冻真空干燥法毒力稳定,其他保藏方法超过12个月后毒力出现不同程度的下降.采用室温斜面法保藏2个月,菌种生物学特性和毒力均稳定,操作最简便,适宜短期保藏;采用冷冻真空干燥法保藏24个月以上,或采用-20℃脱脂牛奶法保藏20个月,菌种生物学特性均稳定,这2种方法适宜长期保藏.     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

EMA-LAMP方法快速检测食源性副溶血性弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合,建立一种能快速检测食品中食源性副溶血性弧菌活细胞的新方法.结果表明,EMA-LAMP方法最低检测限为1×10 CFU/mL,PCR方法最低检测限为1×103 CFU/mL.与PCR方法相比较,EMA-LAMP检测方法具有快速、灵敏度高、操作简便等优点,并能检测鉴定副溶血性弧菌病原活细胞.     

副溶血性弧菌分子检测与分型研究进展

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌,常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等,及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等,这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段,对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。     

副溶血性弧菌ELISA快速检测试剂盒的研制

副溶血性弧菌间接ELISA检测试剂盒的主要组成部件,应用试验结果表明该试剂盒检测低限达104 cfu/g,具有良好的稳定性和特异性;检测时间为8 h,大大缩短了检测时间,提高了检测效率,该试剂盒具有一定的实际应用价值.     

不同样品副溶血性弧菌多样性分析

采用肠细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)2种方法,对从3种不同样品中分离得到的副溶血性弧菌进行分型分析;通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NT-SYS-pc软件,并采用Dice系数对指纹图谱进行聚类分析.结果显示:55株副溶血性弧菌REP-PCR指纹图聚谱共分为3大类,其中底泥中的优势谱型为Ⅰ类型,海水中的优势谱型为Ⅱ类型,虾样品中的优势谱型为Ⅰ类型;ERIC-PCR指纹谱型也聚类为3大类,在海水和底泥中的优势谱型均为Ⅰ类型,但底泥中副溶血性弧菌多样性较海水中丰富,虾样品中副溶血性弧菌优势谱型为Ⅱ类型.表明不同样品中副溶血性弧菌优势型不同,进而推测不同类型谱型的菌株耐冷特性不同.     

应用酸性电解水联合超声波杀灭副溶血性弧菌

将酸性电解水与超声波技术相结合,探究其对副溶血性弧菌的杀灭情况,并与其他杀菌措施进行对比。采用平板计数法进行菌落计数,扫描电镜观察细菌的形态变化,蛋白质泄漏揭示细胞膜通透性差异,并结合流式细胞仪分析生物学特征的改变,分别比较了酸性电解水、超声波以及联合处理对副溶血性弧菌的杀菌效果。结果显示:酸性电解水联合超声波处理可使副溶血性弧菌的数量减少2.09 log CFU/mL,亚致死菌数量为1.80 log CFU/mL,而仅用超声波处理,细菌只减少了0.63 log CFU/mL,亚致死菌数量为0.05 log CFU/mL(P0.05)。扫描电镜结果表明,电解水联合超声波处理对副溶血性弧菌的细胞结构有明显的破坏作用,结合二喹啉甲酸法(BCA)显示其细胞内蛋白质泄漏226.596μg/mL(P0.05)。进一步的流式细胞仪分析结果显示,经联合处理后细菌细胞明显缩小,颗粒度变化增大。综上所述,相较于酸性电解水或超声波单一处理,通过菌落计数,细菌的形态变化,蛋白质泄漏与细胞生物学特征的改变可知,酸性电解水联合超声波的处理方式具有更强的杀菌效果,可作为一种新型的技术应用于水产品中副溶血性弧菌的杀灭。     

水产品副溶血性弧菌不同增菌液增菌效果的比较

[目的]对用不同方法检测水产品副溶血性弧菌的不同增菌条件进行比较,以期寻找一种快速高效的增菌条件,为提高检测效率提供聋考依据。[方法]采用FDA、ISO、GB／T4789．7-2003、GB／T4789．7-2008、SN0173等方法中的培养基配方,时副溶血性弧菌进行杂种培养,并通过生长曲线测定方法比较验证使用培6-基的增菌效果。[结果]结果表明,含3％NaCl的碱性蛋白胨具有最好的增菌茵效果。[结论]该结果对于检测水产品中副溶血性弧菌具有重要的指导意义。     

PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

在我国,副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素,因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准,但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测,但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA,容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,简称PMA)等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR(qPCR)结合,应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测,但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此,拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析,以便为进一步开展相关研究提供参考。     

副溶血性弧菌外膜蛋白的提取与免疫鉴定

[目的]为进一步确定致病性副溶弧菌共有的特异性抗原和保护性抗原奠定基础。[方法]通过小鼠毒力试验研究5株副溶血性弧菌菌株对小鼠的致病性,比较在不同培养基和培养时间下所提取的外膜蛋白的SDS-PAGE图谱并通过Western blotting分析研究副溶血性弧菌菌株的免疫原性。[结果]5株临床分离的副溶血性弧菌菌株明显对小鼠具有不同的致病性,同时能在兔血平板上形成明显的溶血圈,为TDH阳性菌株。通过菌体免疫获得的多克隆抗体,与除副溶血性弧菌外的其他试验菌株均无交叉反应。Western blotting分析显示该多克隆抗体与5株致病性副溶血弧菌菌株可发生程度不等的阳性反应,提取的外膜蛋白具有较好的免疫原性。[结论]该研究为制备有效预防副溶血性弧菌引起的疾病的菌苗提供了理论基础。     

海产品中4种副溶血性弧菌检验方法的研究

分别采用国家标准MPN法、纸片法、改良MPN法(R-MPN)和疏水网格滤膜法(HGMF)对50个海水及牡蛎样品进行检测。结果表明,R-MPN法和HGMF法的检出量比另外2种方法高,差异显著(P<0.05)。纸片法的特异性最高,其次是HGMF法,R-MPN法和MPN法的特异性相对较低。本文通过比较4种副溶血性弧菌检验方法的检出量和特异性,以期为今后的检测方法改进提供参考。     

副溶血性弧菌外膜蛋白K的多表位串联表达研究

[目的]设计和表达Omp K蛋白的多表位串联肽,综合评价其免疫效应。[方法]构建重组表达质粒p ET-32a-repis并进行原核表达,使用Ni-NTA纯化介质对表达产物进行纯化得到重组多表位串联肽(r EPIS),以r EPIS为免疫原免疫昆明小鼠,对r EPIS进行免疫原性和免疫保护性研究,Western-blot分析r EPIS的免疫反应性。[结果]r EPIS具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高水平抗体,并且能够保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保护效应,Western-blot结果显示重组r EPIS能够与免疫后鼠血清进行特异性结合,具有良好的免疫反应性。[结论]该研究制备的重组r EPIS具有良好的免疫特性,为副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物质基础。     

不同振动模式对副溶血性弧菌生物被膜形成的影响

为了探究食品工厂环境下更为真实的生物被膜形成过程,有效地预防和控制食品加工过程中副溶血性弧菌生物被膜的污染情况,通过模拟不同的食品加工器械振动模式（水平旋转式振动,翘板式振动,垂直翻转式振动）,研究了不同振动模式下副溶血性弧菌在玻璃和不锈钢表面培养72 h生物被膜的形成过程,分析了不同振动模式对被膜生物量、被膜结构以及被膜胞外基质中胞外多糖和胞外蛋白的影响。结果发现,振动条件下副溶血性弧菌被膜形成量明显减少;3种振动模式下垂直翻转式振动条件下被膜生成量最少;同种振动方式下副溶血性弧菌在不锈钢表面形成量大于玻璃表面;增加水平旋转转速,被膜生成量减少;振动导致被膜总生物量减少,多孔性和均一性增加,生物被膜结构趋于简单,被膜比较分散。振动导致生物被膜胞外多糖和胞外蛋白含量减少。以上结果说明,不同的器械振动对被膜的影响不同,本研究中模拟的三种振动模式中选择垂直翻转式振动模式可以有效地减少与抑制生物被膜的生长;振动会导致细菌生物被膜胞外多糖和蛋白的减少,影响被膜的孔径、均一性等结构特性,被膜结构变得松散,被膜生成量减少,为进一步研究实际生产环境中生物被膜的清除提供理论参考。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

浙江省海产品中副溶血性弧菌污染情况分析

2011-2012年对浙江省11个市的消费市场中的缢蛏、海带、花蛤、泥蚶、蛤蜊等海产品,参照GB-T 4789.7—200方法进行副溶血性弧菌分离,并用双重PCR法确定该菌的携带情况。230批次样品检测结果显示,有85批次检出副溶血性弧菌,平均检出率为36.96%。     

致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响

以9∶1和1∶1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC 33847:tdh+/trh-/tlh+;ATCC 17802:tdh-/trh+/tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2:tdh-/trh-/tlh+;G8:tdh-/trh-/tlh+)在TSB培养基和熟虾中分别进行了混合和37℃10 h的混合培养,通过菌落原位杂交技术和PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。结果显示,在TSB和熟虾中,致病菌比例均出现了下降。在熟虾样品中致病菌株下降的比例更高,其中ATCC17802和G8在熟虾样品中以9∶1比例混合并混合培养10 h后,致病菌比例从90%降为0。表明混合培养对致病性副溶血性弧菌菌株生长产生不利的影响,是造成水产样品中副溶血性弧菌感染频发却很难分离到致病性菌株的原因之一。     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

湛江市海水鱼中副溶血性弧菌的分离鉴定及致病性分析

为了解湛江市海水动物副溶血性弧菌的带菌感染率及其致病性,从湛江市水产品市场随机采集海水鱼样品30份,根据中华人民共和国国家标准和进出口标准规定的副溶血性弧菌的检验方法,结合科玛嘉弧菌显色培养基分离试验,对采集样品进行了副溶血性弧菌的分离与鉴定;并用神耐川试验、溶血试验和脲酶试验检测了分离菌株的致病性。结果显示：30份海水鱼样品分离得到10株副溶血性弧菌,检出率为33.33%。其中,神耐川试验溶血强阳性5株,弱阳性2株,阴性3株;在3.5%NaC l兔血琼脂平板上,本试验分离到的10株副溶血性弧菌均呈现较强溶血作用;10株分离菌株脲酶试验均为阴性。     

副溶血性弧菌Ⅲ型分泌系统与Ⅵ型分泌系统的研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种常见的革兰氏阴性细菌,主要分布在海洋、海口和河口沉积物中,能够引起人急性肠胃炎、伤口感染和败血症,同时危害水产品养殖业。由该菌引起的食物中毒事件在全世界范围内频繁发生,该菌被认为是微生物性食物中毒的主要病原菌之一。影响副溶血性弧菌致病性的毒力因素包括溶血素、黏附因子、分泌系统等,尤其在分泌系统中,Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion systems, T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)与副溶血性弧菌致病性密切相关。T3SS是一种多亚基针状结构,将分泌蛋白通过供体细胞质直接注入受体细胞质;T6SS是一种接触依赖性蛋白分泌装置,将毒素直接注入目标细胞内。通过对Ⅲ型分泌系统和Ⅵ型分泌系统的研究进展进行梳理,从这两种分泌系统的结构出发,并对其功能和调控机制分别进行分析比较,指出了二者在效应蛋白及产生毒素上的不同,找出了二者与副溶血性弧菌定植的关系,以期通过这两者的联系进而深入了解副溶血性弧菌的致病机制,为防治该菌提供科学指导。