猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为快速灵敏地检测血清中猪圆环病毒2型(PCV2)的抗体水平,本研究以PCV2-YW株基因组为模板扩增PCV2-dCap基因,原核表达去除N端41个氨基酸的PCV2重组衣壳蛋白(dCap).将dCap标记胶体金颗粒制备金标垫,将重组Protein A和兔抗dCap多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)作为检测线(T线)和...     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达与鉴定

为获取猪圆环病毒3型衣壳蛋白(PCV3-Cap蛋白),本试验参照PCV3 HBBD1810毒株(GenBank登录号：MK105924)的基因组序列信息合成cap基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a中，对重组质粒进行测序和双酶切鉴定后，将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，对最佳IPTG诱导浓度和诱导表达时间筛选，并对目的蛋白表达后的存在形式进行检测以及对纯化条件进行筛选，透析复性后利用鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体进行Western blot以验证目的蛋白的反应原性。结果显示，通过构建原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白；破菌处理后目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中；0.2 mmol/L IPTG 37℃下诱导培养8 h后蛋白表达量较高；在300 mmol/L咪唑洗脱时纯化出清晰条带；经过Western blot验证目的蛋白能够被鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体识别，具有良好的反应原性。结果表明，本试验成功构建了PCV3-Cap蛋白表达载体，成功表达PCV3-Cap蛋白，同时优化了表达和纯化条件，为PCV3亚单位疫苗的研制以及检测试剂盒的开发和研究提供...     

表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

为制备携带猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169～aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829～aa837)的融合基因(PCV2-Cap^169～180-E2^829～837)经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化...     

猪圆环病毒3型河北株Cap蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪圆环病毒3型cap蛋白,依据NCBI发表的PCV3全基因序列(MK105924)设计了一对特异性引物,通过PCR方法获取PCV3-CAP蛋白基因,将纯化的PCV3-CAP蛋白基因插入到pET-32a(+)质粒中构建重组质粒pET-32a(+)-PCV3-Cap,将构建成功的质粒转化到表达菌株BL21(DE3)...     

猪圆环病毒2型山西流行株Cap蛋白可溶性表达与免疫原性分析

为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显...     

抗猪圆环病毒2b/2d亚型衣壳蛋白纳米抗体的制备与鉴定

采用原核表达系统表达了PCV2b/2d-Cap的重组纳米抗体，并对其与PCV2b和PCV2d亚型Cap蛋白的结合能力进行了初步探索。以羊驼筛选到的纳米抗体基因为模板，通过PCR将纳米抗体基因片段进行扩增。经双酶切及连接反应后，将纳米抗体基因片段(VHH)插入到经改造的pET28a-SUMO载体中，构建了pET28a-SUMO-VHH重组质粒。将构建好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。表达产物通过亲和层析、除去SUMO标签以及分子筛凝胶过滤层析进行纯化。并通过Bio-dot Western blot和间接ELISA方法检测了该纳米抗体与PCV2b/2d-Cap蛋白的结合能力。结果显示，构建的重组质粒测序正确；经纯化得到的纳米抗体蛋白约为14 kDa;间接ELISA证实该纳米抗体对PCV2b/2d-Cap蛋白检测下限均为0.68 mg/L。结果表明，该纳米抗体与PCV2b和PCV2d亚型Cap蛋白均具有交叉反应，为PCV2b/2d亚型的临床检测建立新型诊断方法奠定了基础。     

猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达与鉴定

为了表达猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3) Cap蛋白,按照昆虫细胞密码子偏嗜性对ORF2基因进行优化并在N端加上His标签基因,合成的ORF2基因片段克隆入pFastBac Dual杆状病毒穿梭载体;将重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac感受态后通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-C2;将重组杆粒转染至SF9细胞5 d后收集细胞上清液;连续传代3次观察细胞病变。将接毒后的SF9细胞样通过Western blot及间接免疫荧光(IFA)进行Cap蛋白表达的鉴定。利用蔗糖密度梯度离心对病毒样颗粒的Cap蛋白纯化后进行透射电镜观察。结果显示：SDS-PAGE和Western blot检测发现重组杆状病毒在昆虫细胞中能够有效表达Cap蛋白,且与His-tag单抗及PCV3阳性血清发生特异性反应;IFA进一步鉴定感染了重组病毒的昆虫细胞与His单抗产生特异性荧光;透射电镜可以明显观察到14～17 nm左右形态规则的病毒样颗粒(VLPs)。PCV3 Cap蛋白的成功表达和鉴定将为研究Cap蛋白的免疫原性和空间结构奠定基础,也为探讨开发PCV3的亚单...     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白及传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的VLPs自组装表达与免疫效力评价

为了利用同一重组大肠杆菌实现不同种动物疫病来源类病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)的高效组装表达,试验将编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白的核苷酸序列分别克隆至pET28a-Rcodon载体中,并分别转化至改造的BL21(DE3)△lpxM tig⁺感受态细胞中,利用纳米粒度电位仪及透射电子显微镜分析目的蛋白表达后的胞内组装情况,并用纯化后的抗原蛋白制备的疫苗免疫动物进行免疫效力评价。结果表明：PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白的可溶性表达水平较优化前对照组均分别提高90%左右,且目的蛋白在胞内高效自组装形成了VLPs,并排列呈均一的晶格结构;含VP2抗原的亚单位疫苗可提供100%的保护效果,含PCV2抗原的亚单位疫苗的抗体水平较高,显著高于阴性对照组纯化后的抗原蛋白制备的疫苗(P<0.05)。说明PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白在BL21(DE3)△lpxM tig⁺感受态细胞中均可实现高效可溶性表达与细胞内VLPs自组装,且免疫原性良好...     

重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示:2.0×10^6/mLHigh five细胞浓度、1.5MOI病毒感染量、蛋白表达时间168h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在High-five细胞中的表达条件优化、鉴定及免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示：2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性双价纳米抗体原核表达及活性鉴定

以猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VHH_(cap)基因为模板,通过PCR分别克隆下游片段VHH_(down)和带(G_4S)_3-linker接头序列的上游片段VHH_(up),通过两步酶切连接反应,将VHH_(down)片段插入到pCold-SUMO载体中构建VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒,再将VHH_(up)片段插入到构建成功的VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒中,构建双价单特异性纳米抗体原核重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,表达产物经Ni~(2+)亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE鉴定;通过间接ELISA方法测定纯化后的双价纳米抗体重组蛋白biVHH_(cap)的效价水平,并与相同浓度的单价纳米抗体蛋白VHH_(cap)的ELISA效价进行比较分析。结果表明,重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO构建正确,Cap蛋白双价单特异性纳米抗体重组蛋白在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为45 ku;该双价纳米抗体与其单价组分相比,ELISA抗体效价提高约20倍,Cap蛋白双价纳米抗体的制备为PCV2的抗原检测和PCV2相关疾病的防控提供了新型候选抗体工具。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物.结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在...     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

旨在利用原核表达系统在大肠杆菌中制备出猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),用改良的镍亲和层析法纯化并在小鼠体内评价其免疫原性。通过PCR方法从发病猪中扩增出PCV2的ORF2序列,对其全长进行密码子优化并交由公司合成重组质粒pET-32a-yCap;以BL21(DE3)为表达菌株,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE与Western blot对Cap蛋白的表达方式及抗原特异性进行鉴定;利用改良的镍亲和层析法纯化带有His-Tag标签的重组蛋白;利用透射电镜观察所纯化的载体融合蛋白能否形成VLP;用自制的VLP疫苗与PCV2灭活疫苗(ZJ/C株)分别免疫小鼠,利用商业化PCV2 IgG抗体ELISA检测试剂盒评价其免疫原性。结果显示,成功得到PCV2 ORF2序列和重组质粒pET-32a-yCap,重组质粒在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白形式表达,蛋白大小为47 kDa;经镍亲和层析法纯化可得到单一的目的蛋白;重组Cap蛋白能与PCV2多克隆抗体及HRP标记的6*His, His-Tag小鼠单克隆抗体发生特异性结合;经过磷钨酸负染色的蛋白悬液在透射电镜下可观察到大量规则的、直...     

猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化.采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法.结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1h和30 min.该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4％,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测.     

猪圆环病毒3型ORF2基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

试验旨在建立一种快速的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增,并利用原核表达系统进行截短表达,以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:PCR扩增了片段大小为348 bp的ORF2基因主要抗原区域,PCR扩增产物克隆至pET-32a原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明具有良好的反应活性。以重组蛋白作为包被抗原建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法,对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480;用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见疫病阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%。应用该方法检测四川地区533份不同日龄临床猪血清样品,PCV3阳性感染率达14.82%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,为我国商品化PCV3血清学抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用

为了建立一种敏感和特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法,对PCV3-Cap蛋白抗原表位预测发现其抗原表位多聚集在C端(羧基端),而N端前33氨基酸为核定位序列。以截断N端前120个氨基酸后的PCV3ORF2序列为靶基因,设计引物。以PCV3阳性病料为模板,PCR扩增截短的ORF2基因,并将其克隆至pET-30a载体构建重组质粒,并转染至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得重组菌后选择最佳诱导表达条件,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV3间接ELISA (indirectELISA)诊断方法,并初步用于临床样品检测。结果:从阳性病料中扩增出大小为285bp的PCV3ORF2基因片段,重组质粒经双酶切和测序鉴定构建成功。采用1mmol·L-1 IPTG诱导,在37℃条件下培养6h重组菌,重组蛋白获最佳表达。Western blot结果表明,该重组蛋白与PCV3阳性血清具有较好的反应原性。ELISA的最佳包被抗原质量浓度为1μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶20,酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000。阳性判定值为S/P≥0.273。批内和批间系数均小于10%,表明该方法具有较好的重复性。PCV2阳性血清用本方法检测为阴性,表明该方法有较好的特异性。检测采集的439份临床猪血清,PCV3抗体阳性检出率为60.59%(266/439)。结果表明,本研究建立了一种快速、简便、敏感、特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。     

猪圆环病毒2型Cap羧基端多肽原核表达及抗原性分析

本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。