棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

多功能氧化酶系与甜菜夜蛾对氯氟氰菊酯抗药性的关系

比较了甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)抗氯氟氰菊酯品系和敏感品系5龄幼虫中肠、脂肪体及体壁微粒体细胞色素P450的含量,结果表明,抗性和敏感品系不同组织细胞色素P450的含量均为中肠＞脂肪体＞体壁,抗性品系中肠、脂肪体及体壁细胞色素P450的含量分别是敏感品系的1.78、1.54及1.37倍。中肠微粒体甲氧试卤灵-O-脱甲基酶、乙氧试卤灵-O-脱乙基酶、乙氧香豆素-O-脱乙基酶、芳香基羟基化酶及艾氏剂环氧化酶的活性测定结果表明,抗性品系中肠5种酶的活性分别比敏感品系的酶活性提高1.33、1.73、1.40、1.51及1.30倍,说明甜菜夜蛾对氯氟氰菊酯的抗药性与微粒体多功能氧化酶活性的提高密切相关。     

氰戊菊酯和苯巴比妥钠(PB)对棉铃虫细胞色素P450含量的影响

用 0 .2 mg/ g氰戊菊酯和 2 mg/ g苯巴比妥钠 (PB)拌饲料处理不同时间 ,对敏感种群 (HDS)和抗性种群 (KQR)棉铃虫不同组织的 P4 50诱导作用不同。两种诱导剂对 HDS种群棉铃虫的中肠、脂肪体和体壁的 P4 50都有明显的诱导作用 ,其中 PB诱导的最高倍数分别达 2 .2 4、2 .0 3和 1.6 0倍 ,氰戊菊酯诱导的最高倍数分别达 2 .14、2 .83和 1.2 8倍 ;两种诱导剂对 KQR种群棉铃虫的部分组织 P4 50也有一定的诱导作用 ,但不及对 HDS棉铃虫的显著 ,最高诱导倍数只有 :中肠 1.2 1倍 (PB)和 1.15倍 (氰戊菊酯 ) ,脂肪体 1.72倍 (PB) ;诱导作用除了表现出种群差异性 ,还表现出诱导剂差异、时间效应和组织特异性。尽管不同组织被诱导的程度不同 ,但两种群中中肠和脂肪体的 P4 50相对更容易被诱导 ,诱导倍数也较高 ;诱导达到最大值所需时间一般为 12～ 4 8h不等 ;两种诱导剂中 ,PB比氰戊菊酯对棉铃虫不同组织的P4 50具有更强的诱导作用。     

2-十三烷酮诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera）细胞色素P450 CYP6B6时空表达规律的研究

植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫细胞色素P450 [WTBX]CYP6B[WTBZ]6基因的过量表达,以6龄棉铃虫（[WTBX]Helicoverpa armigera[WTBZ]）幼虫为对象,研究2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用,并对其表达规律进行了初探。分别采用实时荧光定量PCR（qRT PCR）和免疫组化的方法,分析棉铃虫在终浓度为10 mg·g-1 的2-十三烷酮胁迫下,不同时间及不同组织部位[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达变化规律。qRT PCR结果显示：用添加了2-十三烷酮的人工饲料饲喂棉铃虫不同时间后,在头壳中[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 mRNA的表达量一直低于对照组,到48 h时与对照组具有显著差异（[WTBX]t4=15.32,P[WTBZ]=0.000 1）;在脂肪体中随着时间的推移,表达量呈升高趋势,在36 h 已过量表达（[WTBX]t4=7.627,P[WTBZ]=0.001 6）;在24 h时体壁和中肠组织的表达量分别较对照组提高了2.06倍和7.16倍,之后表达量均呈现先降低后升高的趋势,且在48 h时达到最大。免疫组化结果显示：在棉铃虫幼虫组织中发现CYP6B6蛋白在体壁、脂肪体、中肠中均有表达,相比之下在体壁中表达量较高。该研究为深入了解棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定了基础。     

瑞香狼毒素对菜粉蝶幼虫的杀虫活性

在本实验室前期工作中,发现生长于青藏高原的有毒植物瑞香狼毒对菜青虫具有较好的防治效果.采用微量点滴法研究瑞香狼毒素对菜青虫的触杀活性,以叶片夹毒法和灌喂法研究胃毒活性.在触杀活性试验中,72h的致死中量(LD50)为0.96μg/头,以6.25×103mg·L-1浓度的样品液2μL点滴试虫,即1.25×10μg/头处理组的72h校正死亡率为92.2%.在胃毒活性试验中,72h叶片夹毒法的致死中浓度(LC50)为3.82×103mg·L-1,5.00×104 mg·L-1浓度处理组校正死亡率为91.2%;72h灌喂法的LD50为3.80μg/头,以5.00×104mg·L-1浓度的样品液2μL灌喂试虫,即1.00×102μg/头的处理组的72h校正死亡率为96.8%.结果表明,瑞香狼毒素对菜青虫具有较好的触杀活性和一定的胃毒活性.     

肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应研究

采用PRiME HLB固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱仪,建立了斑马鱼中肟菌酯残留的检测方法,并在此基础上研究了肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:在0.0001~0.05 mg/L范围内,肟菌酯进样质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系;当添加水平分别为0.0005和0.05 mg/L时,肟菌酯在水样中的平均回收率为86.6%~106%,相对标准偏差 (RSD)为5.1%~8.9%;添加水平分别为0.01、0.1和10 mg/kg时,其在鱼肉中的平均回收率为70.5%~104%,RSD为1.4%~3.3%。肟菌酯在水样中的定量限 (LOQ)为0.0005 mg/L,在鱼肉中的LOQ为0.01 mg/kg。利用所建立的方法,研究了在水生生物鱼类的1/10急性毒性基准剂量 (ALB) 值 (7.15 × 10?4 mg/L) 和ALB 值 (7.15 × 10?3 mg/L)、斑马鱼的1/100 LC₅₀值 ( 5.10 × 10?4 和1.20 × 10?3 mg/L)以及1/10 LC₅₀值 (5.10 × 10?3和1.20 × 10?2 mg/L)剂量暴露下,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:经不同浓度肟菌酯连续暴露192 h后,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集系数 (BCF)为113~178,具有中等生物富集效应。研究表明,生产中在使用肟菌酯时,应考虑其低浓度暴露下因生物富集作用而对水生生物引起的生态毒理学风险。     

狭叶菖蒲乙醇提取物对棉铃虫卵和幼虫的生物活性

为筛选安全高效的棉铃虫防治药剂,选用狭叶菖蒲Acorus calamus var.angustatus乙醇提取物对棉铃虫Helicoverpa armigera卵和幼虫的触杀活性、胃毒作用、拒食效果和生长抑制作用进行了测定,同时以0.5%藜芦碱为药剂对照,对比分析狭叶菖蒲提取物的杀虫效果。结果表明,狭叶菖蒲乙醇提取物对棉铃虫3龄幼虫有显著的触杀、胃毒、拒食和生长抑制活性以及杀卵效果,且生物活性随浓度升高和处理时间延长而增加;狭叶菖蒲提取物对棉铃虫触杀活性、胃毒活性、杀卵活性的致死中浓度LC_(50)分别为20.50、19.26和31.39 mg/m L,对棉铃虫生长抑制中浓度EC_(50)和拒食中浓度AFC_(50)分别为7.15、10.43 mg/m L;0.5%藜芦碱药剂对棉铃虫触杀活性、胃毒活性和杀卵活性LC_(50)分别为12.19、16.90和29.87 mg/m L,对棉铃虫EC_(50)和AFC_(50)分别为3.99、8.32 mg/m L,均低于菖蒲根茎提取物。气相色谱-质谱分析结果显示,狭叶菖蒲乙醇提取物主要成分为α-细辛醚、β-细辛醚、菖蒲酮和白千层醇。表明狭叶菖蒲乙醇提取物有开发为新型植物源农药的潜力。     

9种生物制剂对甘薯长喙壳菌的抑制作用及防治效果

为筛选防治甘薯黑斑病的生物农药,测定了9种生物制剂对甘薯长喙壳菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用,并进行了防治效果验证。结果表明,四霉素对分生孢子萌发以及菌丝生长均表现出最强的抑制作用,EC50分别为0.10和0.15 mg/L;丁子香酚次之,EC50分别为0.24和0.93 mg/L。四霉素对薯苗黑斑病具有较好的防治效果,当接种甘薯长喙壳菌分生孢子浓度为5×104孢子/m L时,四霉素有效用量6与9 mg/L处理的防治效果分别为66.67%和78.57%;当接种浓度为5×105孢子/m L时,四霉素有效用量6与9 mg/L处理的防治效果分别为77.44%和90.23%。本研究为生物农药应用于甘薯黑斑病的防治提供了依据。     

棉铃虫BR-C Z4基因的克隆及表达分析

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad-complex,BR-C）Z4亚型在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理的棉铃虫幼虫中肠转录组数据克隆获得BR-C Z4的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,对其氨基酸序列和编码蛋白质进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）技术分析BR-C Z4基因在棉铃虫不同龄期、不同组织和2-TD处理6龄幼虫中的表达规律以及其和Ⅳ型几丁质酶（chitinase IV,CHT4）编码基因在4~6龄初、末期幼虫中的表达规律。结果表明,克隆获得的棉铃虫BR-C Z4基因的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量和理论等电点分别为49.8 kD和7.75,且主要定位于细胞核中。系统进化分析结果显示,棉铃虫BR-C Z4与家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta的BR-C Z4亲缘关系最近。BR-C Z4基因在棉铃虫整个生长期均有表达,在3龄期的相对表达量最低而在预蛹期的相对表达量最高;该基因在棉铃虫6龄幼虫的脂肪体、中肠、体壁和头部均有表达,在头部的相对表达量最低,在中肠中的相对表达量最高; BR-C Z4和CHT4基因在棉铃虫4~6龄末期幼虫中的相对表达量均显著高于4~6龄初期幼虫;相关性分析结果显示BR-C Z4和CHT4的相对表达量呈极显著正相关;随着2-TD处理浓度的增加,棉铃虫BR-C Z4基因的相对表达量总体呈现先上升后下降的趋势,其中15 mg/g浓度处理20 h时BR-C Z4基因相对表达量达到峰值,而20 mg/g浓度处理6 h时BR-C Z4基因相对表达量降到最低,为对照的22.73%。推测BR-C Z4基因在棉铃虫变态发育和应对2-TD胁迫过程中发挥着重要作用。     

棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶的活性分布和发育期变化及植物次生物质的诱导作用

对棉铃虫 Helicoverpa armigera (Hübner)谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）发育期活性进 行了跟踪测定。从卵期开始，GSTs活性呈上升趋势，6龄幼虫达到最高，然后逐渐下降，但化蛹初期仍维持较高水平；用培养基混药法研究发现，芸香苷和2-十三烷酮诱导种群5龄时 活性即达到峰值。6龄幼虫脂肪体GSTs活性最高，中肠次之，头部和表皮最低。用1-氯-2, 4-二硝基苯（CDNB）作底物时，中肠GSTs的 Km值最小。5龄幼虫中肠匀浆液中，GSTs活性90%以上集中在细胞液层，在微粒体、线粒体和细胞碎片层的分布均不超过5%；芸香苷诱 导种群3龄幼虫微粒体层GSTs活性分布明显比对照种群减少，而上清液层则比对照种群 有所增高。     

新疆地区棉铃虫自然种群对Bt棉的抗性频率监测

为监测新疆棉区棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)田间种群对Bt棉的抗性频率,在2010年和2011年分别采集石河子和喀什地区莎车的棉铃虫单雌系,以Cry1Ac毒蛋白作为人工饲料,用单雌系F1/F2代法进行棉铃虫种群抗性个体检测。2010年筛选了123个石河子的棉铃虫单雌系,2 011年筛选了152个莎车的棉铃虫单雌系。两地的棉铃虫种群均没有筛选到相对平均发育级别≥0.8的抗Bt棉个体,估算出石河子和莎车的棉铃虫种群的抗性频率低于10-3。莎车F2单雌系与其对应的F1单雌系相对平均发育级别有明显差异。研究表明新疆石河子地区田间棉铃虫种群仍保持敏感状态,喀什地区田间棉铃虫种群对Bt棉的耐受性增高。     

防治棉铃虫的高毒农药替代品种研究

采用室内浸卵、浸叶和点滴法以及田间小区试验,对19种杀虫剂防治棉铃虫的作用特点和效果进行了系统研究。室内生物测定结果表明:多杀菌素对棉铃虫卵孵化有较好的抑制作用,90.40 mg/L多杀菌素处理后棉铃虫卵的孵化率仅为42.86%;多杀菌素、甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、辛硫磷、丙溴磷、毒死蜱和高效氯氰菊酯对棉铃虫初孵幼虫的毒杀作用明显,原药稀释1.0×104~2.0×104倍时可使初孵幼虫死亡率达100%;昆虫生长调节剂——氟啶脲、氟铃脲、甲氧虫酰肼原药稀释1 000倍对棉铃虫初孵幼虫的致死率大于70％,且幼虫的生长受到明显抑制;甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、多杀菌素、毒死蜱、高效氯氰菊酯、丙溴磷、辛硫磷对低、高龄棉铃虫幼虫均具有较好的毒杀效果。田间小区试验结果表明,甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、丙溴磷、高效氯氰菊酯作用效果快且防治效果好,尤其是4 000倍甲氨基阿维菌素和5 000倍高效氯氟氰菊酯处理后第三天,其对棉铃虫的致死率达100％;多杀菌素和甲氧虫酰肼作用效果稍差。若在棉铃虫卵高峰期适时施药,供试的6种药剂均可作为防治棉铃虫的高毒农药替代品种。     

Interaction of Cry1Ac toxin (Bacillus thuringiensis) and proteinase inhibitors on the growth, development, and midgut proteinase activities of the bollworm, Helicoverpa zea

Potential resistance development to Bt cotton in certain lepidopterans has prompted research to develop strategies that will preserve this environmental-friendly biotechnology. Proteinase inhibitors are potential candidates for enhancing Bt toxicity against lepidopteran pests and for expanding the spectrum of control for other insects. Interactions of Bt toxin from Bacillus thuringiensis and proteinase inhibitors were investigated by monitoring growth, development, and gut proteinase activities of the bollworm, Helicoverpa zea. Several proteinase inhibitors were combined with Bt protoxin Cry1Ac in artificial diet and fed to newly molted 3rd-instar bollworm larvae to determine effects on larval body weight and length, pupation progress, and mortality rate. Major midgut proteinase activities, including caseinase, tryptic, and chymotrypsin activities, were examined after treatment. A concentration of Bt at a level causing minimal mortality (<10%), was mixed with the following proteinase inhibitors: benzamidine, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and N-α-tosyl-l-lysine chloromethyl ketone (TLCK). When compared with controls, the synergistic effect of Bt toxin and proteinase inhibitors caused significant decreases in mean larval weight and length over time. Midgut samples tested against the substrates azocasein, α-benzoyl-dl-arginine-p-nitroanilide (BApNA), and N-succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine-p-nitroanilide (SAAPFpNA) showed significant decreases in the protease activity of larvae fed Bt plus inhibitor versus control. Interaction of Bt and proteinase inhibitors significantly retarded larval growth and resulted in developmental delay and up to 20% mortality.     

棉铃虫C型凝集素抑制多角体病毒体内增殖

为探究C型凝集素（C-type lectin）在病毒传播中的可能作用,采用半定量RT-PCR法检测了棉铃虫Helicoverpa armigera不同C型凝集素在核型多角体病毒（nuclearpolyhedrosis virus,NPV）感染后的表达变化,并通过real-time qPCR和RNA干扰技术研究了NPV在棉铃虫体内的增殖状况及对棉铃虫致死率的影响。结果显示,在感染NPV后,棉铃虫血细胞C型凝集素Ha-lectin1和Ha-lectin5基因表达变化明显,其中Ha-lectin1在血细胞和脂肪体中的表达显著上调;注射dsRNA后,Ha-lectin1基因相对于actin的表达量均值由0.19下降到0.04,下降幅度达79%,显示Ha-lectin1基因被成功干扰。随着Ha-lectin1基因的沉默,病毒滴度由0.0015快速升高到1.95,棉铃虫的死亡率也随之增加到97.7%。表明C型凝集素能够抑制NPV在棉铃虫体内的增殖。     

Isolation of insect microsomal oxidases by rapid centrifugation

Only about 60% of the total relative gravitational force conventionally used to sediment microsomes is needed to prepare highly active microsomes from the midgut tissues of an insect larva. A rapid preliminary centrifugation for 2 min at 39,000g_max effectively removed contaminating microorganisms, tissue debris, nuclei, and mitochondria. The supernatant was recentrifuged for 20 min to 210,000g to sediment the microsomes. There were no losses of microsomal oxidase activities or degradation of cytochrome P-450 to the inactive form (P-420) resulting from the application of the higher gravitational force. Incorporation of 1 mM EDTA in the buffer and washing the microsomes resulted in an improved yield of the cytochrome compared to that in microsomes prepared in sucrose. Yields of microsomal protein, cytochrome P-450, and NADPH-cytochrome c reductase in the rapidly isolated microsomes were as good as those in conventionally prepared microsomes. The apparent kinetic characteristics of several microsomal oxidation activities and optical difference spectra of Types 1 and 2 ligands were identical in the rapidly and conventionally prepared microsomes. The morphological appearance of the microsomes was examined by electron microscopy. Microsomal pellets prepared by either method were indistinguishable. The rapid procedure saves significant time in microsome preparation and yields microsomal oxidase activities as good or slightly better than those prepared by usual centrifuged procedures.     

Biochemical and physiological changes on Bacillus thuringiensis cotton after imidacloprid foliar spray

Bacillus thuringiensis cotton is a variety of cotton genetically modified to contain a gene derived from B. thuringiensis bacteria; which results in expression of toxin protein that confers resistance to bollworm complex (the most destructive pest of cotton). Introduction of Bt cotton lowered the need of insecticides, but still a number of insecticides are used for other insects like jassids, whitefly, aphids and tobacco caterpillar to which Bt gene does not provide effective control. Imidacloprid (tradename Imidacel 17.8 SL) is an insecticide designed for control of these major sucking/piercing insects that affect cotton. So in the present work we studied the post effect of imidacloprid insecticide on plant health of three Bt cotton hybrids (RCH-134, JKCH-1947, NCEH-6R) as there are reports of this insecticide causing growth and yield enhancements in absence of insect pests. Imidacloprid was first sprayed at recommended concentration (40 ml/acre) on 3 months old plants sown in randomly designed plots with three replications of each hybrid. The spray was repeated three times at 10 days interval. The level of B. thuringiensis gene expression, peroxidase activity and total phenols was measured on third day after every spray in leaves along with growth and yield of plants. The insecticide has shown to increase the level of B. thuringiensis protein, peroxidase enzyme activity, total phenols, height, number of bolls retained on plants and yield. These observations suggested that the imidacloprid treated plants showed better growth and development, thereby imidacloprid has growth enhancing effect on Bt cotton plants in addition to its insecticidal properties.     

苏云金杆菌与杀灭菊酯防治红铃虫的试验

苏云金杆菌(Bailus thuringiensis)140或018工业菌剂每亩用200～255克,加杀灭菊酯20%乳剂每亩8毫升混用防治第二、三代红铃虫,虫口减退率和铃害下降率分别为80.5～93.4%和68.8～84.6%;杀灭菊酯每亩40毫升单用效果分别为96～97.2%和84.6～95.8%,都能有效控制红铃虫的危害。棉花产量测定表明,菌剂加菊酯混用使皮棉增加21.3～30.9%,菊酯单用增加11.4%。     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。