多功能氧化酶系(MFO)与棉铃虫抗药性关系初步研究

本文在增效作用测定基础上 ,研究比较了多功能氧化酶系 (MFO)的三个组分 (细胞色素 P4 50、细胞色素 b5、细胞色素 c还原酶 )在相对敏感棉铃虫 (HDS)与抗氰戊菊酯棉铃虫 (KQR)中的含量、活性及其组织分布规律。增效作用测定结果表明 ,PBO及 SV1对氰戊菊酯具有显著的增效作用 ,增效倍数分别达 2 53.99和71.4 4倍 ;初步表明 MFO在 KQR种群棉铃虫的抗药性中起着重要作用 ;随后的生化研究表明 :KQR种群棉铃虫中肠、脂肪体及体壁的三个组分含量均显著或极显著高于 HDS种群棉铃虫相应部位的含量 ,其中细胞色素 P4 50在上述三个部位中的含量分别是 HDS种群棉铃虫的 1.76、3.12、4 .15倍 ,细胞色素 b5含量分别是HDS种群棉铃虫的 1.57、6 .2 8、2 .39倍 ,细胞色素 c还原酶活性分别是 HDS种群棉铃虫的 1.4 0、1.88、1.6 4倍 ,说明多功能氧化酶系与棉铃虫的抗药性密切相关。     

氰戊菊酯和苯巴比妥钠(PB)对棉铃虫细胞色素P450含量的影响

用 0 .2 mg/ g氰戊菊酯和 2 mg/ g苯巴比妥钠 (PB)拌饲料处理不同时间 ,对敏感种群 (HDS)和抗性种群 (KQR)棉铃虫不同组织的 P4 50诱导作用不同。两种诱导剂对 HDS种群棉铃虫的中肠、脂肪体和体壁的 P4 50都有明显的诱导作用 ,其中 PB诱导的最高倍数分别达 2 .2 4、2 .0 3和 1.6 0倍 ,氰戊菊酯诱导的最高倍数分别达 2 .14、2 .83和 1.2 8倍 ;两种诱导剂对 KQR种群棉铃虫的部分组织 P4 50也有一定的诱导作用 ,但不及对 HDS棉铃虫的显著 ,最高诱导倍数只有 :中肠 1.2 1倍 (PB)和 1.15倍 (氰戊菊酯 ) ,脂肪体 1.72倍 (PB) ;诱导作用除了表现出种群差异性 ,还表现出诱导剂差异、时间效应和组织特异性。尽管不同组织被诱导的程度不同 ,但两种群中中肠和脂肪体的 P4 50相对更容易被诱导 ,诱导倍数也较高 ;诱导达到最大值所需时间一般为 12～ 4 8h不等 ;两种诱导剂中 ,PB比氰戊菊酯对棉铃虫不同组织的P4 50具有更强的诱导作用。     

棉铃虫对化学杀虫剂的抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种世界性分布的重大杂食性农业害虫,长期大量使用化学药剂防治棉铃虫导致其对不同种类杀虫剂产生了抗性。抗性分子机制的阐明有利于棉铃虫的科学防控和抗性治理。该文主要综述棉铃虫对化学杀虫剂的抗性发展现状,以及近年来棉铃虫抗药性分子机制的研究进展,包括解毒酶代谢能力增强、靶标敏感性降低和表皮穿透能力下降等方面,并就未来研究工作和棉铃虫抗性治理新技术进行了展望。     

棉铃虫CYP9G5基因的克隆、序列分析及溴氰菊酯胁迫表达

细胞色素P450是超基因家族,属于生物体内重要三大解毒酶系之一,参与内源物和外源物的合成与氧化代谢。本文通过棉铃虫溴氰菊酯短期胁迫转录组数据分析,克隆获得一条P450基因CYP9G5（GenBank：KM016757.1）,编码493个氨基酸,分子量约为57.930 kDa,理论等电点pI 7.16。通过实时荧光定量技术,分析CYP9G5基因在棉铃虫不同组织和溴氰菊酯处理后表达量的变化,发现CYP9G5在头部表达量最高,经过溴氰菊酯处理后CYP9G5表达量也显著升高。推测出CYP9G5极有可能参与棉铃虫对溴氰菊酯的代谢,可能对棉铃虫的耐药性有一定的作用。本研究为进一步探索棉铃虫的抗药性和新农药的开发奠定了基础。     

棉铃虫微粒体多功能氧化酶系组分含量及酶活性在不同生长发育阶段的变化规律研究

细胞色素 P4 50和细胞色素 b5在 KQR和 HDS种群棉铃虫的不同生长发育阶段含量不同 ,但变化规律大致相似 ,均是在 3龄期含量较低 ,从 3龄到 6龄含量上升并达到最高值 ,然后含量逐渐下降 ,直到蛹期达最低值。单加氧酶 MROD和 ECOD在 KQR种群棉铃虫不同生长发育阶段活性大小不同 ,而且变化规律明显不同。从 3龄到 6龄期间 ,MROD活性呈上升趋势 ,并在 6龄期达到最大 ,之后活性逐渐下降 ,在蛹和成虫阶段活性达最小 ;而 ECOD活性在不同生长发育阶段间的差异则不是很大 ,没有明显的阶段表达特异性     

RNAi介导的棉铃虫细胞色素P450酶系几种组分基因沉默对高效氯氰菊酯毒力的影响

为进一步明确细胞色素P450 CYP6B7、细胞色素b5(cytochrome b5,Cyt-b5)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)在棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)对拟除虫菊酯类药剂抗性中的作用,通过RNA干扰技术沉默了抗氰戊菊酯棉铃虫中3种组分的基因,并测定基因沉默后高效氯氰菊酯对棉铃虫的毒力变化.结果显示,经单个CYP6B7或CYP6 B7与CPR、Cyt-b5基因的双链RNA注射处理后12 ～ 48 h,棉铃虫幼虫死亡率在19.4％ ～ 92.5％之间,明显高于空白对照处理的10.47％ ～ 62.87％;高效氯氰菊酯对基因沉默后幼虫的LD50值随着时间的延长而逐渐下降,12～48 h的LD50值在0.97～2.97 μg/头之间,而空白对照处理为2.27 ～ 3.57μg/头.研究表明,细胞色素P450 CYP6B7,或CYP6B7与CPR、Cyt-b5基因的沉默,可提高高效氯氰菊酯对抗性棉铃虫的毒力,进一步证明了CYP6B7、CPR和Cyt-b5在棉铃虫对菊酯类药剂抗性中起着重要作用.     

抗氰戊菊酯棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆及分析

以抗氰戊菊酯棉铃虫六龄幼虫中肠组织总RNA为模板,采用特异性引物,通过对反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的条件进行不断探索和优化,成功克隆出全长为1 557 bp的基因片段(GenBank登录号DQ497428)。该片段包括一个完整的开放阅读框架(1 515 bp)及5'端的42个碱基,编码504个氨基酸残基。与国外报道的细胞色素P450 CYP6B7基因(GenBank登录号AF031468)的核苷酸、氨基酸同源性分别为97.75%和98.81%,为CYP6B7的等位基因。Northern杂交分析表明,抗性品系棉铃虫中肠组织中CYP6B7 mRNA的表达量明显高于敏感品系的,初步表明CYP6B7在棉铃虫对氰戊菊酯的抗药性中起着重要作用。     

吡唑解草酯对小麦细胞色素P450的诱导作用及其光谱特征

用吡唑解草酯浇灌小麦,试验结果表明,50μmol/L吡唑解草酯处理抗6号小麦,可使其细胞色素P450含量达到最大值108.18 pmol/mg蛋白质,为对照组的1.67倍;100μmol/L吡唑解草酯处理敏18号小麦,可使其细胞色素P450含量达到最大值80.97 pmol/mg蛋白质,为对照组的1.86倍。吡唑解草酯对两个小麦品种的细胞色素P450均有诱导作用,抗6号小麦更容易被诱导,这与两小麦品种的耐药性一致。室温(20±1)℃下扫描不同时间的细胞色素P450-CO结合光谱,结果表明,微粒体粗提液室温(20±1)℃保存200 min后,细胞色素P450完全转变为细胞色素P420。     

烟粉虱细胞色素CYP6EM1基因的克隆及对吡虫啉抗性的作用

烟粉虱是一种世界性农业害虫,其防治手段以化学防治为主,新烟碱类杀虫剂吡虫啉常年用于防治烟粉虱,田间烟粉虱已经形成严重的抗药性。本研究通过分析烟粉虱吡虫啉抗性和敏感种群,发现细胞色素CYP6EM1基因在吡虫啉抗性品系中上调了4.7倍,进而克隆了其全长基因,进行了荧光定量PCR分析,发现该基因在吡虫啉抗性烟粉虱3龄若虫期和雄虫成虫期过量表达,并且在抗性成虫胸部和腹部过量表达。最后通过RNA干扰的方法使成虫的CYP6EM1基因表达量下降了54.8%,之后发现当烟粉虱暴露于吡虫啉时死亡率显著升高了39.65%,这表明CYP6EM1与烟粉虱对吡虫啉抗性的形成相关。研究结果对于揭示烟粉虱对吡虫啉产生抗性的机制有帮助,也为烟粉虱抗性水平田间监测及烟粉虱综合治理提供理论依据。     

小菜蛾对阿维菌素的抗性机制及交互抗性研究

用叶片药膜法研究了阿维菌素抗性小菜蛾 Plutella xylostella （L.）品系 对常用药剂的交互抗性谱以及增效醚（PB）和磷酸三苯酯（TPP）的增效作用。小菜蛾对阿 维菌素与高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯等菊酯类药剂间具有比较低的交互 抗性，对后者抗性为3～20倍，对阿维菌素的抗性为575.6倍；对氟虫脲和氟啶脲没有交互抗 性。PB和TPP对阿维菌素分别增效8.2和5.5倍，说明小菜蛾对阿维菌素的抗性可能与多功能 氧化酶（MFO）和羧酸酯酶有关。通过差光谱技术测定了阿维菌素抗性和敏感小菜蛾细胞色 素P450的含量，抗性品系是敏感品系的1.38倍。     

嗜线虫致病杆菌对棉铃虫的生物活性研究

嗜线虫致病杆菌HB310(Xenorhabdus nematophila HB310)菌液中主要的杀虫活性物质是一种高分子量的复合蛋白—毒素Ⅱ。以该菌液和毒素Ⅱ分别饲喂棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫,检测其对棉铃虫生长发育的影响,同时通过生化分析研究了该毒素对幼虫中肠内几种蛋白酶活力的影响。结果表明:菌液和毒素Ⅱ对棉铃虫幼虫的取食量和生长发育均有显著的影响,取食拌有菌液和毒素Ⅱ的人工饲料的棉铃虫食量明显减少,发育速度延缓,发育历期比对照明显推迟;尽管一直取食混合原菌液(6.5×108 cells/mL)人工饲料的棉铃虫2龄幼虫前期死亡率很低,但是其生长发育几乎完全被抑制,该处理组所有幼虫均不能化蛹;原菌液对4龄幼虫的食量、发育历期、蛹重及化蛹率均有显著影响。菌液对棉铃虫幼虫的影响与菌液的浓度和幼虫的龄期成反比,稀释50倍的菌液对2龄和4龄幼虫的生长发育仍有一定影响;毒素Ⅱ(51.9 μg/mL)对4龄棉铃虫的生长发育也有明显的抑制作用。短时间(2 d)饲喂原菌液后更换正常饲料,仅延缓了棉铃虫幼虫的发育历期,而对其化蛹率、蛹重及羽化率均无明显影响。饲喂毒素Ⅱ的棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶的活性受到明显的抑制。     

棉铃虫抗辛硫磷品系的代谢抗性机理

通过重复回交和药剂选择,将棉铃虫Phoxim-R抗性品系对辛硫磷的抗性导入到BK77敏感品系中,得到棉铃虫BK77-R抗性品系,BK77-R和BK77为一对近等基因系。BK77-R抗性品系对辛硫磷的抗性达155倍,对溴氰菊酯有高水平交互抗性(抗性倍数248倍),对灭多威和硫丹有中等水平交互抗性, 分别为31倍和11倍,对丙溴磷有低水平交互抗性(4倍)。在BK77-R抗性品系中,脱叶磷(DEF,酯酶抑制剂)对辛硫磷、灭多威和硫丹具有增效作用,增效倍数分别为7倍、2倍 和1.9倍;增效醚(PBO,氧化酶抑制剂)对溴氰菊酯、灭多威和辛硫磷的增效倍数分别为21倍、2.2倍和1.7倍。与BK77敏感品系相比,BK77-R抗性品系的酯酶和多功能氧化酶活性均显著提高,而谷胱甘肽S-转移酶活性没有明显变化。上述结果表明,酯酶解毒代谢在棉铃虫BK77-R品系对辛硫磷的抗性中起重要作用,酯酶和多功能氧化酶解毒作用增强是该抗性品系对不同类型药剂产生交互抗性的重要原因。     

棉铃虫对甲氧虫酰肼的抗性遗传力

(δp=0.5),抗性现实遗传力为实际筛选估计值的一半,当杀死率为80%和90%时,棉铃虫对甲氧虫酰肼的抗性增加10倍,分别需要34.48代和27.40代.田间条件下,由于等位基因频率变化、环境变异等因素的影响,抗性增加10倍则需要更长的时间.     

嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白对棉铃虫幼虫的生物活性

嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus var.pekingensis CB6菌株是本研究室自主分离的新菌株,其代谢物对棉铃虫具有很强的拒食和抑制生长活性.为了进一步明确代谢物中杀虫蛋白的生物活性,作者用饲料染毒法和叶碟法测定了杀虫蛋白对棉铃虫不同龄期幼虫取食和生长发育的影响.结果表明,杀虫蛋白对棉铃虫幼虫有很强的抑制生长作用,用64μg/g含杀虫蛋白饲料饲喂初孵、1、2和3龄幼虫5天的生长抑制率分别达95.37%、92.73%、87.15%和88.64%,并明显延长幼虫发育历期,影响幼虫的化蛹及蛹的羽化.杀虫蛋白对5龄棉铃虫幼虫拒食效果明显,幼虫饲喂经1.6mg/mL杀虫蛋白处理的叶片24h,选择性拒食率和非选择性拒食率分别为76.22%和85.42%.当蛋白浓度为0.32mg/mL时,24h选择性拒食和非选择性拒食率分别为68.39%和74.75%.     

拟除虫菊酯类杀虫剂对棉铃虫雌蛾化学通讯系统的影响

用低致死剂量（LD30）氰菊酯和氰戊菊酯胸部点滴处理棉铃虫3龄幼虫后，研究拟除虫菊酯类杀虫剂对存活雌蛾化学通讯系统的影响。结果表明，杀虫剂对雌蛾的求偶行为不产生明显影响，对照组和杀虫剂处理组雌蛾的求偶高峰均为第3个暗期的8-8．5h，求偶率均可达73％-82％。氰戊菊酯处理组中雌蛾性信息素各组分滴度和总量与对照无显著性差异，但溴氰菊酯处理组中雌蛾性信息素的主组分Z11-16：Ald和次要组分Z9-16：Ald、Z7-16：Ald的滴度及信息素总量均显著高于对照组，并且两个活性组分Z11-16：Ald和Z9-16：Ald的比例与对照组雌蛾有显著差异。     

防治棉铃虫的高毒农药替代品种研究

采用室内浸卵、浸叶和点滴法以及田间小区试验,对19种杀虫剂防治棉铃虫的作用特点和效果进行了系统研究。室内生物测定结果表明:多杀菌素对棉铃虫卵孵化有较好的抑制作用,90.40 mg/L多杀菌素处理后棉铃虫卵的孵化率仅为42.86%;多杀菌素、甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、辛硫磷、丙溴磷、毒死蜱和高效氯氰菊酯对棉铃虫初孵幼虫的毒杀作用明显,原药稀释1.0×104~2.0×104倍时可使初孵幼虫死亡率达100%;昆虫生长调节剂——氟啶脲、氟铃脲、甲氧虫酰肼原药稀释1 000倍对棉铃虫初孵幼虫的致死率大于70％,且幼虫的生长受到明显抑制;甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、多杀菌素、毒死蜱、高效氯氰菊酯、丙溴磷、辛硫磷对低、高龄棉铃虫幼虫均具有较好的毒杀效果。田间小区试验结果表明,甲氨基阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、丙溴磷、高效氯氰菊酯作用效果快且防治效果好,尤其是4 000倍甲氨基阿维菌素和5 000倍高效氯氟氰菊酯处理后第三天,其对棉铃虫的致死率达100％;多杀菌素和甲氧虫酰肼作用效果稍差。若在棉铃虫卵高峰期适时施药,供试的6种药剂均可作为防治棉铃虫的高毒农药替代品种。     

感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对化学杀虫剂的敏感性

为明确棉铃虫微孢子虫Nosema sp.与杀虫剂混用的效果及其机理,采用感染饲喂和微量点滴法,研究了感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对辛硫磷、溴氰菊酯的敏感性变化.健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷LC50之比为4.855,对溴氰菊酯LC50之比为7.953.随着微孢子虫感染时间和感染剂量的增加,棉铃虫对杀虫剂的敏感性进一步增强;感染微孢子虫5天,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为3.278,与感染3天处理相比差异显著;当剂量为107个孢子/mL时,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为4.090.经微孢子虫处理后,棉铃虫幼虫体内的羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的比活力均增高.     

Toxicity of chlorantraniliprole to Cry1Ac-susceptible and resistant strains of Helicoverpa armigera

Transgenic Bt cotton expressing Cry1Ac is important in controlling various agricultural pests, including Helicoverpa armigera. Especially for transgenic crops that are cultivated in large expanses, avoiding resistance development is a key for ensuring sustainability of Bt technologies. Integrated pest management, in which transgenic crops are strategically combined with rational pesticide use, may help to prevent H. armigera resistance acquisition in Bt cotton. In this study, we evaluated the toxicity of a novel insecticide (chlorantraniliprole) on Cry1Ac-susceptible and resistant individuals of H. armigera. More specifically, we assessed the effect of chlorantraniliprole on the activity of two enzymes and conducted laboratory bioassays to determine its toxicity on H. armigera larvae. Chlorantraniliprole increased esterase and glutathione-S-transferase activities in Cry1Ac susceptible and resistant populations of H. armigera. Cry1Ac resistant populations XJ-F (Cry1Ac resistance ratio 21.8-fold), XJ-10.0 (95.8-fold) and BTR (3536.5-fold) did not show cross-resistance to chlorantraniliprole, with LC₅₀ values of 0.0733 (μg/mL) in XJ-F, 0.0545 (μg/ml) in XJ-10.0 and 0.0731 (μg/mL) in BTR, which were close to that in the susceptible strain 96S (0.0954 μg/mL). Our work shows that chlorantraniliprole could be considered to be integrated in Bt cotton management schemes to delay the H. armigera resistance development.