利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统

为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。     

家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

昆虫转座子及在家蚕中的应用

概述了近年来广泛应用于昆虫的若干转座子及其基本构造和应用;着重讨论了piggyBac转座子的构造和转座机制及所作成的转基因昆虫种类及标记基因:同时列举了在家蚕转基因中的实例.     

家蚕类mariner转座子相关序列分析

通过PCR克隆,从家蚕基因组中获得大小为975bp的DNA片段(登录号:EU352872),Blast搜寻结果显示,该片段DNA序列的52-449nt区域与野蚕mariner-like元件DNA(登录号:AB237562)的同源性达90%,推测为家蚕类mariner转座子相关序列,在乙酰胆碱酯酶基因的第5内含子、微卫星S1104-R序列、BmBRC-NZ3 mRNA终止码的下游序列、ErB·1基因的内含子均检测到家蚕类mariner元件相关序列的同源区,暗示家蚕类mariner元件在家蚕基因组中发生了多次转座,并在家蚕基因组的不同区域随着进化发生了歧化。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

转座子显示技术及其在家蚕遗传进化研究中的应用展望

转座子显示技术是研究基因组中转座子遗传进化的有力工具。家蚕基因组测序结果发现,基因组中含有大量的转座子。本文综述了转座子显示技术和家蚕基因组中转座子特点,展望转座子显示技术在家蚕遗传进化研究中的应用。     

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

PiggyBac转座子及其在家蚕中的应用

转座子可以由染色体的一个位置移动到另外位置,改变原有基因的结构和排序,从而导致基因改变。转座子可分为2大类,第1类转座子又有多种类型,这类转座子能以染色体DNA转录形成的RNA为模板,经反转录酶作用合成DNA并插入到基因组中;第2类转座子则直接在基因组中来回移动,不形成RNA,也与反转录酶的作用无关。用于昆虫重组的转座子几乎都是第2类转座子,其末端具有反向重复序列,中间部分为转座酶基因,此基因可产生转座酶,使末端重复序列与其内侧的目标序列移动,即将目标序列部分切出,并重组到染色体的其它部位上。因此,可利用这类转座子进行转…     

A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。     

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。     

利用杆状病毒系统在昆虫细胞TN5中表达家蚕30K蛋白

为研究30K蛋白抑制细胞凋亡的作用,利用RT-PCR从家蚕总RNA中扩增到30KC19基因,对其进行了序列分析并克隆到杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,构建成重组转座载体pFastBacHTb-30KC19。利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞TN5中进行了表达和蛋白检测。结果表明30K蛋白在昆虫细胞中得到了高效表达。     

家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)基因在大肠杆菌中的表达

为了研究家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)的原核表达及剪切方式,用PCR法扩增出家蚕caspase-1基因的cD-NA,然后插入pET28a载体,得到阳性质粒pET28a-caspase-1,并转化感受态细胞BL21,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导了caspase-1蛋白的表达。应用SDS-PAGE和Western blot分析对其性质作检测,诱导3 h后caspase-1蛋白得到剪切,5 h开始降解。研究结果表明,caspase-1基因可在大肠杆菌BL21中诱导表达,并且能够进行自我剪切。