松材线虫VAPs蛋白的原核表达、多抗制备及表达模式分析

  目的   类毒素过敏原蛋白（VAPs）是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。   方法   本研究利用聚合酶链式反应（PCR）扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量（RT-qPCR）方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（Western-blot）进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。   结果   松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP₁和Bx-VAP₂基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP₃和Bx-VAP₄基因在繁殖型L₃时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAP_n诱导表达的蛋白分子量介于21 ~ 31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体anti-VAP₁、anti-VAP₂和anti-VAP₃均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP₄抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,Bx-VAP₁潜在的优势B细胞抗原表位较多。   结论   重组质粒pET-32b-VAP_n诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP₁、anti-VAP₂和anti-VAP₃效价高,特异性良好,Bx-VAP₁具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。       

松材线虫黄素单加氧酶家族基因结构与表达模式分析

黄素单加氧酶（flavin-containing monooxygenases, FMOs）是一类广泛存在于植物、动物、微生物中，主要参与调控生物体对内源性及外源性物质代谢的生物酶家族。为探究松材线虫FMOs(Bursaphelenchus xylophilus FMOs, BxFMOs)在宿主中定殖和响应杀线剂胁迫过程中所发挥的功能，本研究首先通过生物信息学手段从松材线虫基因组中筛选并鉴定了13个BxFMOs家族基因，随后对获得的BxFMOs家族基因进行理化特性、进化发育、蛋白结构及基因表达模式分析。结果表明：BxFMOs家族成员分布于5条染色体上，氨基酸数目为432～572个，分子量为49.77～66.09 kDa，等电点为6.26～9.27，其结构较为保守。基因表达模式分析揭示，BxFMOs家族对松材线虫定殖和响应杀线剂胁迫具有显著影响。本研究对探索松材线虫在宿主中的定殖机制和寻求防治松材线虫分子靶标具有重要的指导意义和理论价值。     

松材线虫USP基因家族鉴定及生物信息学分析

泛素特异性蛋白酶(USP)作为去泛素化酶的一种，在生物体内细胞发育、信号传递、肿瘤发生和转移及免疫反应等诸多方面发挥着重要功能。通过生物信息学的方法从松材线虫基因组中筛选并鉴定松材线虫USP家族基因19个，通过分析其理化特性、进化发育、蛋白及基因结构及表达模式，为研究USP家族在松材线虫发育中的作用奠定基础。结果表明，松材线虫USP不均匀的分布于6条染色体上；理化性质分析发现松材线虫USP基因家族编码的氨基酸为280～1 384个，分子质量介于31.53～158.94 ku,等电点介于4.77～9.43;基因和蛋白结构分析表明松材线虫USP家族是一个活跃的去泛素化酶家族。根据在不同发育阶段的松材线虫中USP家族表达模式分析发现，松材线虫USP家族对松材线虫胚胎发育和生长过程中具有一定的促进能力。因此，研究松材线虫USP家族的结构和表达模式对解析松材线虫发育趋势具有一定的指导意义，对探索松材线虫防治方法具有参考价值。     

PGP基因家族成员的结构和功能

通过对松材线虫耐药基因家族成员Bx-pgps的基因和蛋白质结构与功能的分析,对该家族成员的耐药机制进行了分析预测。从松材线虫基因组数据库中获得了与秀丽线虫pgp基因家族成员同源的基因,分别命名为Bx-pgp1至Bx-pgp10。对其疏水性、跨膜区域和拓扑异构结构等生物学特性进行了预测。结果表明:Bx-PGPs家族成员可能具有跨膜运输功能。     

木薯NOX基因家族成员的生物信息学及其表达分析

[目的]搜索鉴定木薯还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)基因家族成员,分析其生物学信息及在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,为深入研究该家族基因对木薯块根发育的调控机理及提高木薯抗逆性提供理论参考.[方法]从JGI数据库下载木薯的基因组序列,由pfam数据库下载4个NOX蛋白结构域相关的HMM文件,通过HMMER程序筛选NOX基因家族成员,利用生物信息学分析软件对该家族蛋白的理化性质、氨基酸序列和结构特征进行分析.基于GEO数据库的转录组测序(RNA-Seq)数据,对木薯NOX基因家族成员在不同组织和干旱胁迫下的表达模式进行分析.[结果]从木薯基因组中共鉴定到15个NOX基因家族成员,包括9个NOX基因和6个FRO基因(NOX祖先基因).FRO基因的外显子数(6~9个)明显少于NOX基因的外显子数(11~14个),且FRO基因的内含子序列较NOX基因短,NOX基因的第一个外显子相对保守.15个NOX基因家族成员分布在木薯的9条染色体和1个结构支架上,且均被定位在染色体末端,除6号染色体有4个基因、8号和14号染色体有2个基因外,其他染色体均只有1个基因.木薯NOX蛋白的分子量和氨基酸数明显高于FRO蛋白,而理论等电点(pI)差异不明显.FRO蛋白含6~9个保守跨膜结构域,而NOX蛋白均只含4个跨膜螺旋区,且均位于第350~750位氨基酸残基.木薯NOX家族蛋白有10个保守结构域,其中Motif1和Motif8存在于所有的NOX和FRO蛋白中,Motif6为NOX蛋白所特有,Motif3只独立存在于FRO蛋白中.NOX蛋白均具有典型的保守结构域和相似的蛋白质结构,其脱氢酶结构域明显折叠成催化域裂缝结构,且C末端氨基酸极度保守.由RNA-Seq数据的基因表达谱可知,NOX基因家族成员在不同木薯叶片、中静脉、叶柄、茎、侧芽、茎尖分生组织、根尖分生组织、易碎胚性愈伤组织、胚性愈伤组织(OES)和贮藏根中均有表达,但呈不同的表达模式,其中,Manes.14G042600和Manes.S089900在储藏根中高表达,Manes.06G128700和Manes.09G172500在须根和根尖分生组织中高表达.在木薯品种KU50和新选048的叶片中,Manes.14G042600基因在干旱胁迫下呈上调表达,推测NOX基因在特定组织及响应非生物胁迫过程中扮演重要角色.[结论]木薯NOX基因家族成员具有保守基因结构,其编码蛋白具有保守的功能域,尤其是C端氨基酸序列;NOX基因表达具有组织特异性,部分成员的表达受非生物胁迫的影响.FRO蛋白和NOX蛋白具有较明显的共进化关系.     

松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析

[目的]对松材线虫和拟松材线虫的14-3-3蛋白基因进行全长cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank数据库中14-3-3蛋白EST序列BXC56（登录号为FG589472）、BMCl20（登录号为FG589351）,采用RACE技术获取松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白的全长cDNA克隆Bxl4-3-3a和Bml4-3-3a,并对克隆片段序列进行分析。[结果]Bx14-3-3a全长1039bp,包含一个756bp的开放阅读框,编码蛋白含有251个氨基酸残基,包含2个14-3-3蛋白标签,编码蛋白分子量为61．43kD,等电点为4．88。Bx14-3-3a基因组结构中包含4个外显子和3个内舍子序列。Bm14-3-3a全长992bp。有与Bx14-3-3a编码完全相同的氨基酸序列。序列比对结果表明,14-3-3在真核生物间高度保守,Bx14-3-3A和Bm14-3-3A蛋白在系统进化上与线形动物门（Nematomorpha）的物种近缘关系较近,与植物线虫南方根结线虫（Meloidogyneincognita）系统发育关系上最为亲近。[结论]Bx14-3-3a和Bm14-3-3a的成功克隆,为进一步研究其功能及其调控因子对形态、致病力、繁殖力和环境适应性等方面的分子调控机制奠定了重要基础。     

运用RAPD研究松材线虫与拟松材线虫的亲缘关系

 松材线虫和拟松材线虫同属伞滑刃属(Bursaphelenchus), 两者从形态上极难区分, 但对松树的危害却有本质的差别.本文运用RAPD技术对来自日本、美国、加拿大、中国等地的18个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系基因组 DNA 多态性进行研究.在事先优化的条件下, 从OPA, OPJ, OPK, OPL, OPM, OPN,6组共120个随机引物中, 筛选出15个扩增效果较好的随机引物(OPA03, OPJ12, OPK06, OPK07, OPK08, OPM14, OPM16,OPM17, OPM19, OPM20, OPN02, OPN06, OPN08, OPN13, OPN15), 分别用它们对上述26个松材线虫和拟松材线虫种群进行RAPD扩增, 一共扩增出165 条谱带, 其中151条为多态性谱带, 占总条带数的91.5%, 但未发现能够区分松材线虫和拟松材线虫的特征性差异谱带.     

松材线虫耐药基因克隆及其功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐药的分子机理,对松材线虫耐药基因Bx-mrp1进行鉴定并对其蛋白结构及功能进行了研究。在松材线虫基因组数据中得到松材线虫与秀丽线虫(Caenorhabditis elegans) mrp1具有同源性的基因,命名为Bx-mrp1,并比较了松材线虫Bx-mrp1与相近线虫属之间的mrp基因差异。对松材线虫Bx-mrp1完整蛋白编码区(CDS)进行PCR扩增后,运用RNAi技术对该基因进行基因沉默,分析沉默该基因后对松材线虫死亡率的影响。通过PyM OL软件对Bx-MRP1蛋白质进行三维结构预测。结果表明:在NCBI中,通过BLAST比对,Bx-mrp1与秀丽线虫mrp1同源性为43%。Bx-MRP1蛋白质包含32个α螺旋和18个β折叠,以及含有3个TMD和2个NBD结构,具有多个跨膜结构域,表明Bx-mrp1具有跨膜运输的功能。通过PCR得到松材线虫Bx-mrp1基因CDS区全长为4 659 bp。在对Bx-mrp1基因沉默后,发现RNAi处理组的松材线虫在同质量浓度的苦参碱药剂胁迫下的死亡率有所增加,在多药耐药生理过程中起正向调控作用。     

NtGNL2基因克隆及蛋白结构分析

ARF-GEFs家族基因是近年来极性生长研究的热点。该家族有多个亚家族,而在植物中以GBF亚家族为典型代表。NtGNL2(Nicotiana tabacum GNOM-Like2)是通过同源克隆,并结合3'Race技术在烟草中克隆获得的GBF家族成员,在植物上报道的GBF家族成员并不多,然而,该亚家族成员的蛋白序列及功能都高度保守。为了验证新获得的Nt GNL2基因的保守性,通过同源比对和系统发生关系分析了NtGNL2与其他多个植物GBF家族成员的亲缘关系;同时对NtGNL2基因各个保守结构域进行了蛋白序列的分析。结果表明,NtGNL2与其他植物GBF成员高度保守。     

松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆了一个松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2,该基因cDNA全长为2 010 bp,有1 878 bp的开放阅读框(ORF),推测其编码的蛋白有625个氨基酸;Bx-ace-2基因组克隆长为2 192 bp,含有7个内含子.氨基酸序列比对和同源性分析显示:松材线虫Bx-ace-2编码的乙酰胆碱酯酶与已报道的秀丽小杆线虫ACE-1、ACE-3和ACE-4型乙酰胆碱酯酶的相似性为28%～31%,而与秀丽小杆线虫ACE-2及甘薯茎线虫、南方根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯白线虫和胎生网尾线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列相似性为44%～52%.构建的系统进化树也显示:松材线虫乙酰胆碱酯酶与其他线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶具有相对更近的遗传距离,因此推测该松材线虫乙酰胆碱酯酶也属于ACE-2型.     

低温调控Bx-SCD促进松材线虫脂肪积累

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)低温胁迫条件下进入滞育状态的分子机理,应用Blast比对技术,在松材线虫基因组中鉴定得到秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)scd的同源基因,命名为Bx-SCD。应用PCR技术进行Bx-SCD完整蛋白编码区扩增,分析了低温胁迫下Bx-SCD表达量,并采用改良油红-O染色法测定低温胁迫后松材线虫脂肪相对积累率。结果表明:PCR扩增得到779 bp产物,Bx-SCD编码338个氨基酸,等电点为8.77,相对分子质量为39.532 78 ku。该蛋白属于质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族蛋白,具有fa_desaturase结构域。低温胁迫下Bx-SCD表达量显著上调,同期松材线虫脂肪相对积累率显著上升。低温胁迫正向调控Bx-SCD基因表达,促进松材线虫脂肪积累,有助于松材线虫在低温胁迫条件下进入滞育状态并存活。     

野菊花GRF基因家族的鉴定和生物信息学分析

运用生物信息学对野菊花中植物生长调控因子(Growth Regulation Factors,GRF)基因家族成员的一些基本理化性质、蛋白质的亚细胞定位、进化树的构建、基因结构、保守结构域和保守基序、潜在磷酸化修饰位点以及蛋白质二级结构进行分析发现,野菊花GRF蛋白家族多数成员氨基酸数量相差不大,15个家族成员亚细胞定位均在细胞核。通过进化树构建、基因结构和保守基序、保守结构域分析发现,QLQ和WRC这两个结构域在大部分家族成员中存在,且亲缘关系相近的GRF家族成员所含有的保守基序也十分相似。     

榛属ycf1基因生物信息学分析

为研究ycf1基因家族成员在榛属(Corylus)中的生理功能,利用榛属叶绿体基因组数据库,经过生物信息学分析,获得榛属ycf1基因家族成员的基因结构、定位和编码蛋白,经过多重序列比对进行进化和分类分析。结果表明,榛属叶绿体基因组中的ycf1基因家族成员不含有内含子;TMHMM跨膜区结构分析显示,榛属YCF1蛋白均不含有跨膜区;MEME保守结构域分析显示,榛属YCF1蛋白均含有3个保守结构域。研究结果对解析榛属YCF1蛋白的生物学功能提供重要的线索。     

Opaque2转录因子对玉米α-醇溶蛋白基因家族成员表达的影响

醇溶蛋白是玉米主要的储存蛋白,其中α-醇溶蛋白含量最为丰富,对玉米籽粒品质有重要影响。本研究利用全基因组数据鉴定α-醇溶蛋白基因家族,并从基因保守motif、玉米籽粒不同发育时期基因的表达谱以及转录因子Opaque2对该家族成员表达的影响3个方面分析玉米α-醇溶蛋白基因家族。结果显示,玉米参考基因组中存在39个α-醇溶蛋白基因,其中z1A、z1B、z1C和z1D 4个亚族成员分别为12个、8个、14个和5个。基因保守motif分析发现该家族基因序列高度保守。表达谱分析结果显示该家族表达模式差异较大,其中z1A亚族在籽粒发育时期表达量最高。利用RNA-seq数据剖析在种子发育阶段Opaque 2(O2)野生型和突变体编码该家族成员的表达差异,结果显示O2突变体中z1C亚族成员表达显著下调,z1A亚族表达略有下调,z1B和z1D亚族成员表达量没有显著的变化。本研究在重新注释α-醇溶蛋白家族成员信息的基础上,对该家族的表达谱进行了分析,为今后玉米籽粒品质育种提供了必要遗传信息。     

松材线虫与拟松材线虫杂交及后代繁殖力

为了探明松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)与拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)能否进行种间杂交,收集了不同地理来源的松材线虫和拟松材线虫株系,在实验室内进行了种间杂交、继代培养以及回交。结果显示:中国浙江松材线虫和法国拟松材线虫、中国浙江松材线虫和中国拟松材线虫杂交组合,具有较高的交配率、繁殖量和低死亡率。在继代培养试验中,这2个组合都具有很强的繁殖优势,其杂交后代可以同亲本回交,且更趋于同拟松材线虫回交。总的来说,松材线虫和拟松材线虫有些虫株间是可以杂交并能够顺利繁殖,建立可延续的种群的。推测在自然条件下,松材线虫和拟松材线虫杂交后代是存在的。     

松材线虫病致病机理的研究进展

概述了近年来国内外学者在松材线虫病致病机理研究方面的进展。该病害的致病决定因子主要包括几个理化特性,(1)由线虫食道腺产生的细胞壁水解酶,通过作用寄主细胞壁来帮助线虫侵入、扩散,最终影响寄主水分传输;(2)松材线虫分泌的部分蛋白会参与到与寄主细胞的互作中来;(3)松材线虫本身产生的植物毒素和其携带的细菌分泌的毒素可使寄主松树萎蔫;(4)松材线虫表面蛋白的作用。     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

松材线虫磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1基因的克隆及表达

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。     

杨树天冬氨酸转氨酶基因家族鉴定及表达分析

[目的]鉴定杨树天冬氨酸转氨酶(ASPAT)基因家族成员,并检测其组织表达特异性,为研究ASPAT在杨树初级氮素同化中的生物学功能提供参考依据.[方法]从杨树基因组数据库中筛选鉴定ASPAT基因家族成员,利用生物信息学软件分析各基因家族成员序列和基因结构及编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和保守基序等,并利用实时荧光定量PCR检测正常施氮处理(1 mmol/L NH4NO3)下其在杨树根、茎和叶中的组织表达特异性.[结果]从杨树基因组中共鉴定出9个ASPAT基因家族成员,包括7个真核型ASPAT(AAT)基因(PtASPAT1~PtASPAT7)和2个原核型AS-PAT(PAT)基因(PtASPAT8~PtASPAT9),编码区(CDS)序列长度1215~1791 bp,编码的氨基酸数目304~480个,外显子数7~14个,编码蛋白的等电点5.66~8.99,相对分子质量33.11~53.31 kD,脂融指数76.36~93.54,分别定位于叶绿体、线粒体和胞质中,除PtASPAT6和PtASPAT7为不稳定蛋白,其他均为稳定蛋白.拟南芥和杨树的ASPAT蛋白可聚为两大类,Ⅰ类为AAT蛋白,包括PtASPAT1~PtASPAT7和AtASPAT1~AtASPAT5;Ⅱ类为PAT蛋白,包括PtASPAT8、PtAS-PAT9和拟南芥PAT(AtPAT).PtASPAT1~PtASPAT6均含有5个保守基序,PtASPAT7缺少2个保守基序,PtASPAT8和PtASPAT9均仅含有1个与AtPAT相同的保守基序.9个杨树ASPAT蛋白均含有磷酸吡哆醛结合位点(SGTHNYSSK)、同源二聚体多肽结合位点(GAVAER)和催化残留活性位点(K).正常氮素处理下,PtASPAT1基因在杨树根、茎和叶中表达量无明显差异;PtASPAT2~PtASPAT9基因在根部的表达量较在茎和叶中的高,尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因表达量较高.[结论]杨树ASPAT基因家族成员主要在根部表达,尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在杨树根部的初级氮素同化中发挥重要作用.