奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二重PCR检测方法的建立

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。选取金黄色葡萄球菌的Nuc基因和大肠杆菌16S-23SrRNA基因作为扩增靶基因序列,设计两对特异性引物。通过正交试验优化反应条件建立二重PCR检测体系,优化结果表明二重PCR扩增出两条特异性条带,大小与实验设计的249bp(金黄色葡萄球菌)和375bp(大肠杆菌)相符,而对其它奶牛乳房炎主要病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出14.6pg的金黄色葡萄球菌模板和26.0pg的大肠杆菌模板。使用该二重PCR检测29份临床奶样,发现其中17份携带相关基因,并分离得到相关致病菌。     

荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立

为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒.标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5 α及JM109均无交叉反应.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段.     

PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测     

兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH₂O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

四川省动物性食品源金黄色葡萄球菌的耐药性分析

近年食源致病菌的耐药性引起重视,为了解四川省动物性食品源金黄色葡萄球菌(SA)的耐药情况,本试验采用NCCLS推荐的肉汤微量稀释法,对源自四川省动物性食品中的113株SA进行了25种抗生素(组合)的敏感性试验.结果:SA对青霉素G(93.81%)、氨苄两林(92.92%)、甲氧苄啶(92.92%)和磺胺异噁唑(88.5%)的耐药率很高;所有菌株均对苯唑西林.头孢类(先锋唑啉、头孢曲松、头孢噻呋),阿米卡星,强力霉素,喹诺酮类(恩诺沙星、洛美沙星、诺氟沙星)敏感;对其他药物不同程度耐药;113株SA对25种抗生素(组合)共产生了47种耐药谱,主要对青霉索类、磺胺类和大环内酯类表现出多重耐药.四川省动物件食品源SA耐药情况与其他地区的差异不明显,没有检测出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌.     

乳制品中金黄色葡萄球菌定性检测方法探讨

本方法是在国标金黄色葡萄球菌定性方法的基础上终结自己多年的经验,并论述了在检测过程中注意的事项,供同行参考探讨.     

金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究进展

金黄色葡萄球菌是引起人类细菌性食物中毒及奶牛乳房炎的重要细菌之一,在自然界中广泛分布。本文将重点介绍金黄色葡萄球菌的几种快速检测方法。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌8种毒力基因的PCR检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)主要毒力因子的分布情况,本试验利用PCR对70株临床型乳房炎、55株隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的8种主要毒力基因进行检测。结果显示,nuc、ClfA、TSST-1、PVL、Hla、Hlb、FnBPA和FnBPB 8种毒力基因在临床型乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(70株)、100.0%(70株)、0(0株)、5.7%(4株)、100.0%(70株)、11.4%(8株)、97.1%(68株)和100.0%(70株);在隐性乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(55株)、100.0%(55株)、0(0株)、70.9%(39株)、98.2%(54株)、9.1%(5株)、100.0%(55株)和100.0%(55株)。结果表明,nuc、ClfA、Hla、Hlb和FnBPA 5种毒力基因是引起奶牛乳房炎的SA的最主要毒力基因;PVL基因可能是引起隐性乳房炎的重要致病基因。     

牛源金黄色葡萄球菌间接ELISA检测方法的建立

本研究将牛源金黄色葡萄球菌按照不同梯度浓度进行包被,采用矩阵法摸索最佳包被抗原浓度及优化其他EUSA反应条件,以建立检测牛源金黄色葡萄球菌抗体间接ELISA方法,并与试管凝集试验进行了敏感性与阳性检出率的比较.结果表明,经矩阵法确定抗原的最佳包被浓度为10<'8>cfu/mL.最适包被条件为37℃,抗体的最佳使用稀释倍数为1:100.酶标山羊抗兔IgG的工作浓度为1:5000.本研究建立的牛源金黄色葡萄球菌抗体EUSA检测方法,在敏感性与特异性方面均优于试管凝集试验,是一种快速准确检测牛源金黄色葡萄球菌抗体的方法.     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。     

PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌

为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度为1.25×103cfu/mL。本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点。     

PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌

为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定.结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带.敏感性检测的最低浓度为1.25×103 cfu/mL.本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点.     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子及荚膜基因的PCR检测

为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)的因型特征,本实验利用聚合酶链式反(PCR)方法,对S.aureus的3个标准株和30个临床分离株的凝集因子A、凝固酶、溶血素等33种致病因子进行了检测.结果表明各分离株在毒力因子方面存在一定差异.这些差异的检测将为进一步研究S.aureus的致病性和有效防治提供参考.     

产毒金黄色葡萄球菌在低温贮藏食品中的存活及其产毒情况

因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒,早在1914年Barber已有报道,Deck(1926)所作的经典工作进一步证实由于食用葡萄球菌污染的蛋糕而引起食物中毒。自此以后,世界上很多的学者都进行了这方面的研究工作,并进一步证实了Deck的研究,特别是1948年前后美国食品和药物实验室的Carman和食品研究所的Surgallu及Bergdoll开始了对这一课题的多方面的研究。 至今在世界许多地区,金黄色葡萄球菌还一直是食源性中毒的重要原因,金黄色葡萄球菌在自然界无所不在,人和动物是其主要贮存所,该菌细胞在干燥情况下能生存数月,但极易受到热的破坏,在低温条件下     

牛乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的PCR检测应用研究

采集92份患隐性乳房炎牛的乳汁,分别用PCR法和常规法进行致病菌检测,常规细菌鉴定法检测出金黄色葡萄球菌感染样18份,无乳链球菌感染样30份;双重PCR检测出金黄色葡萄球菌感染样22份、无乳链球菌感染样27份。本试验从基因水平对致病性乳汁进行检测,具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强等特点。     

动物源性金黄色葡萄球菌耐药性的检测

用K—B法对52株动物源性金黄色葡萄球菌进行了17种抗生素耐药性检测。结果，试验菌对16种抗生素的耐药率达19．2％～84．6％，耐药率最高的为氨苄青霉素，最低的为头孢曲松；其中对12种抗生素的耐药率在50．0％以上；在52株金黄色葡萄球菌中最少的耐2种抗生素，最多的耐15种抗生素，表明临床分离的金黄色葡萄球菌株均表现高水平耐药和多重耐药；受试菌均对万古霉素敏感。     

奶牛金黄色葡萄球菌2种抗体检测方法的建立及比较

用超声波处理的金黄色葡萄球菌抗原和灭活的菌体抗原，初步建立了2种检测奶牛金黄色葡萄球菌抗体的检测方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）和玻片凝集试验，并用建立的检测方法对已知免疫背景的血清样品进行检测。结果显示，ELISA的阳性检出率为60．5％（50/87），玻片凝集试验的阳性检出率为56．2％（49/87），两者总符合率为82．8％（72/87）。表明两种方法均可用于奶牛金黄色葡萄球菌抗体的检测，其中ELISA检测方法更敏感。     

3种鼠源致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究以沙门菌组氨酸转运操纵子hut基因、肺炎克雷伯菌外膜蛋白Pho E基因以及金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶基因,建立了同时检测这3种致病菌的多重PCR方法,并对混有3种致病菌的盲肠内容物分别采用传统细菌分离培养法和PCR方法进行检测,同时对混有3种致病菌的粪便样品进行PCR检测。该方法能扩增出目的片段分别为495 bp、333 bp、279 bp。在优化条件下,多重PCR同时检测沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的敏感度分别为1.23 pg、1.9 pg、1.185 ng DNA。分离培养法对沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的最低检出限分别为1×10~2CFU、1×10~0CFU和1×10~2CFU。混合有3种致病菌的盲肠内容物和粪便,经增菌培养后,PCR法的最低检出量均为1×10~0CFU。本研究建立的多重PCR检测方法具有特异性及灵敏度高、操作简单、周期短的优点,适用于实验小鼠多种致病菌的快速检测和监控。