红锥ISSR—PCR扩增体系的优化

对广西红锥种群的DNA进行提取和ISSR—PCR扩增体系进行优化。分析了退火温度、模板DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。红锥ISSR—PCR分析较适宜的扩增体系是：25μL PCR反应体积中，buffer（10mM Tris-HCl，pH9．0，50mM KCl，0．1...     

4种不同广玉兰基因组DNA提取方法的比较

采用常规CTAB法、常规SDS法、改良CTAB法、改良SDS法4种方法对广玉兰（Magnolia grandiflora）叶片基因组DNA的提取进行比较,并进行ISSR—PCR检测,结果表明：改良的CTAB法提取的基因组DNA效果比常规CTAB法、常规和改良SDS法都好,提取DNA的浓度和纯度高,无蛋白质和RNA等杂质影响,并且可以很好的应用于ISSR分子标记分析,ISSR—PCR反应体系中模板DNA的最佳浓度是30ng／20μl．     

思茅松大配子体DNA的提取及ISSR反应体系的建立

为建立思茅松大配子体ISSR分子标记的反应体系,以思茅松种子样本作为供试材料,比较不同思茅松胚乳DNA提取方法的效果,通过紫外分光度计、DNA琼脂糖电泳和PCR扩增分别予以检测并比较。结果表明SDS法优于CTAB法。同时,通过单因子分析法对ISSR-PCR反应体系中的模板DNA用量,Taq DNA聚合酶用量,Mg2＋浓度,dNTP浓度、引物浓度等主要影响因子进行优化,确立适用于思茅松的ISSR分子标记反应体系。对该体系进行稳定性检验,结果表明该反应体系适合思茅松ISSR-PCR扩增。     

山茱萸叶片DNA提取方法及ISSR反应体系构建

山茱萸成熟叶片中多糖及多酚类物质含量较高,传统CTAB法提取其叶片DNA效果较差,该研究在传统的CTAB提取法的基础上进行了改良,经DNA原液电泳检测及PCR产物的电泳检测表明,该法适用于提取硅胶快速干燥保存的山茱萸叶片的DNA。在此基础上,对山茱萸ISSR反应体系中的退火温度、引物浓度及模板用量进行了筛选,结果表明,在25μL的反应体系中,引物UBC847的最佳退火温度为55.2℃,引物最佳浓度为0.8μmol/L,模板最佳用量为70 ng,初步构建了山茱萸ISSR反应体系。     

杠柳ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

为建立适用于杠柳ISSR分子标记研究的扩增体系,进一步利用ISSR标记研究杠柳遗传多样性,探讨了杠柳ISSR分子标记中的各影响因素,分别对河北11个不同地区杠柳基因组DNA进行PCR扩增,在Taq MasterMix(康为世纪)基础上对影响ISSR-PCR扩增结果的模板DNA浓度、循环次数、引物退火温度进行梯度筛选。结果表明:在100条通用引物中共筛选出34条扩增条带清晰、整齐的ISSR引物;确立了适合杠柳ISSR分子标记的反应体系:总反应体积25μL,其中Taq MasterMix(含DNA聚合酶、MgCl_2、dNTPs、反应缓冲液以及稳定剂)12.5μL,模板DNA 1μL(70ng/μL),正向引物和反向引物各1μL(10μmol/L)。该体系的确立为今后利用ISSR技术对杠柳种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

江南油杉ISSR-PCR反应体系建立与引物筛选

为了建立江南油杉(Keteleeria fortunei var.cyclolepis)ISSR-PCR最佳反应体系,以江南油杉嫩叶为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,通过单因素实验设计,进行ISSR-PCR反应体系和反应条件优化,并筛选出多态性ISSR引物。实验结果表明:江南油杉ISSR-PCR最佳反应体系为25μL体系中模板DNA 40 ng,引物浓度为0.8μmol/L,2×Taq PCR Master Mix用量为12μL。利用该体系从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、特异性好的6条引物(UBC807、UBC809、UBC811、UBC812、UBC835、UBC841)。     

鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。     

贯叶金丝桃的繁殖

近年来,多年生花卉在城市园林绿化及景观配置中正逐渐受到人们的重视,并取得了较好的观赏效果。贯叶金丝桃又名贯叶连翘,为藤黄科植物的一种,多年生草本,它叶形优美,易管理,繁殖快,全草可入药,除临床用于抗抑郁,抑制中枢神经作用外,还是一种有前途的内源性光敏剂,可用于肿瘤的光化学诊断和治疗。维吾尔族人民早先用它治疗寒性肿痛,小便不通,肺炎等,外敷可治烧伤及关节炎等。金丝桃属植物以鲜黄色的花瓣,密集而细长的雄蕊以及状似桃花的花冠而得名,贯叶金丝桃正以其特有的药用价值及园林观赏特性而深受越来多的药物学家和园林学者的青睐。     

李ISSR反应体系的优化

以李品种杏梅(hybrid)和斯顿莱(Prunus domestica)为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对李ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μl的反应体系中，模板DNA含量对扩增结果影响不大，在10—80ng均能得到较好的扩增；椰用量对扩增无明显影响；而Primer、Mg^2 的最适浓度分别为0．25μmol／L、0.25mmol/L；Taq酶在0．5～1．0U均能得到好的扩增条带；退火温度在50-52．1℃范围内均能得到清晰的条带。     

枫香优良观赏种质的遗传多样性分析

利用ISSR标记技术对12份枫香观赏种质进行遗传多样性分析,通过正交实验优化枫香的ISSR-PCR扩增体系,即在20μL体系中加入PCR反应缓冲液2μL、镁离子1.5 mmol.L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4mmol.L-1、DNA模板80 ng。筛选出的19条ISSR引物共得到131条扩增带,其中多态性条带为94条,多态性条带比率为71.75%。12份种质的有效等位基因数是1.482,基因多样性0.3012,Shannon信息指数0.4674,表明遗传多样性水平相对较高。进一步的聚类将这些种质分成3类,其中4号样本和11号样本的遗传相似度最高。     

鸭梨ISSR-PCR反应体系的初步建立

以沧州泊头市鸭梨为试验材料,对鸭梨ISSR-PCR反应体系中的模板DNA用量、dNTPs浓度、引物浓度以及Taq酶浓度进行了探索,初步建立适合鸭梨ISSR-PCR反应体系为：在20μL反应体系中,含1×Taq PCR Buffer[1.5 mmol/L Mg2＋]0、.15 mmol/L dNTPs、0.40μmol/L引物、40 ng DNA和1 U Taq酶。     

桑天牛线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因的PCR反应体系优化

建立一整套适用于研究桑天牛线粒体细胞色素氧化酶I(mtDNA CO I)基因的PCR反应体系,研究不同地理分布的桑天牛遗传多样性。通过L_(16)(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验对缓冲液(Mg~(2+))、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,50μL反应体系及反应程序中各因素优化组合为:缓冲液(含Mg~(2+))0.9mmol/L,dNTP 0.15mmol/L,随机引物0.44μnol/L,TaqDNA聚合酶3.0U,模板DNA75ng;退火温度47℃,循环次数35次。     

台湾水青冈ISSR-PCR体系的优化

分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。     

粗皮桉 ISSR-PCR 反应体系优化

为建立粗皮桉 ISSR-PCR 优化反应体系,先通过单因素试验确定影响粗皮桉 ISSR-PCR 5个因素(Mg²⁺、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物)的较适宜浓度范围,在此基础上进一步通过正交试验对5个因素4个水平进行优化,并用 DPS 软件分析试验结果。结果表明粗皮桉 ISSR-PCR 的优反应体系为：在25μL 反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL、MgCl 2.0 mmol·L^-1、dNTPs 0.3 mmol·L^-1、Taq DNA 聚合酶1.25 U、DNA 模板60 ng、引物0.8μmol·L^-1。通过梯度试验确定的扩增程序为：94℃预变性5 min,然后按94℃变性1 min,51℃退火3 min,72℃延伸2 min,进行35个循环,最后72℃延伸5 min,4℃保存。     

兴安落叶松SSR反应体系的建立与优化

采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。     

枫香ISSR-PCR扩增条件的优化

对浙江省天台山枫香自然种群的DNA进行提取和ISSR-PCR扩增条件的优化。分析了Mg2+浓度、4×dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物用量、Taq DNA聚合酶用量等对反应结果的影响。建立了适用于枫香ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%TritonX-100),2.0 mmol.L-1Mg2+,0.15 mmol.L-14×dNTP,2 mg.mL-1BSA,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.9 U TaqDNA聚合酶,引物UBC808的最适退火温度为52.4℃。用此反应体系对天台山枫香自然种群进行了遗传多样性分析,结果显示其多态位点百分率为84.26%,Nei指数为0.2665,Shannon信息指数为0.4044,其遗传多样性处于较高水平。     

油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

建立稳定可靠的SSR-PCR反应体系、筛选具有多态性SSR引物,是木本油料植物光皮树分子标记辅助育种与良种选育的重要基础研究。为给SSR标记技术在光皮树遗传图谱构建、亲缘关系鉴定及分子育种等方面的应用研究奠定基础,利用"Cf-05"正反向引物,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验相结合的研究方法,对影响光皮树SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、引物、d NTPs、Mg~(2+)、Taq聚合酶浓度及退火温度)进行了试验分析。试验结果表明,光皮树SSR-PCR总体积为15μL的最佳反应体系为:模板DNA用量37.5 ng,正反向引物浓度均为0.6μmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.3 mmol·L~(-1),Mg~(2+)的浓度为1.5 mmol·L~(-1),Taq聚合酶用量为1.5 U,最佳退火温度为50℃。运用优化了的光皮树SSR-PCR反应体系,可从71对引物中筛选获得11对能适用于光皮树的SSR引物。研究结果表明,试验所建立的反应体系可进一步用于光皮树SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面的研究中。