冷冻保存绵羊精子质膜完整性检测的研究

为了探讨冷冻保存对绵羊精子质膜完整性的影响,研究采用低渗肿胀—伊红拒染(HOS-EY)法检测冷冻保存前后绵羊精子质膜的完整性。实验设计了5个HOS-EY低渗染液浓度梯度组合(110、130、1501、70、190mOsm),按精子尾部肿胀与否和头部着色与否区分为4种类型进行统计。结果表明:绵羊冻融精子头膜尾膜均完整的Ⅳ型精子率(22.36%)和头膜尾膜均损伤的Ⅰ型精子率(47.4%)与鲜精比较分别极显著减少(58.64%)和增多(20.94%)(P<0.01),表明冷冻-解冻过程对精子膜造成严重损伤;头膜损伤-尾膜完整的Ⅱ型精子率(28.82%)在冷冻过程中极显著增多(16.72%)(P<0.01),头膜完整-尾膜损伤的Ⅲ型精子在冷冻组发生率(1.72%)显著减少(2.58%)(P<0.05),表明精子头膜或尾膜的损伤是独立发生的,且头膜损伤易于尾膜,5种HOS-EY低渗染液中150 mOsm组对精子尾部肿胀的检测效果最好。     

低温保存对绵羊精子DNA链完整性的影响

为了探讨低温保存对绵羊精子DNA链完整性的影响,采用原位缺口末端标记(TUNEL)法对小尾寒羊新鲜和低温保存精子的DNA链完整性进行检测。结果表明:经24 h、48 h、72 h、96 h处理的低温保存绵羊精液的DNA链断裂精子百分率分别为(0.017 2±0.006 2),(0.028 0±0.0142),(0.037 3±0.017 0),(0.037 1±0.008 8)。与新鲜精液相比,低温保存的精液中DNA链断裂精子百分率虽然略有增加但无统计学差异,表明低温保存对绵羊精子DNA链的完整性没有显著性损伤。     

猪精子体外获能后其质膜完整性的影响

精子质膜功能和结构的完整性对于精子的受精能力十分重要。常规检测，例如曙红染色仅能检测质膜的结构完整性，不能评价质膜的功能性。早在1966年，Dreviuslo等曾描述过哺乳动物精子弯尾（Tailcoiling）现象。低渗肿胀检测（Hypoosmotic swelling test，HOST），最初被用于检测人的精子，也被应用于其他动物，例如猪、火鸡、马、牛等。这种方法能够检测精子质膜的功能状态。HOST的原理是精子质膜能够有选择地运输分子。当被放置到低渗条件下时，水会进入精子内部，并要达到一个平衡，这种内流的水会使精子体积增大、顶体肿胀、尾部弯曲。尾部弯曲这—特征比较明显，因此弯尾率可以作为评价精子质膜完整的标志。     

蜂王浆对低温保存绵羊精子质量和糖转运蛋白GLUTs表达的影响

实验旨在研究稀释液中添加蜂王浆对低温保存绵羊精子质量和糖转运蛋白丰度的影响。通过假阴道法采集8只杜泊公羊精液,将活率不低于0.8的精液混合,分别用含0.00%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%蜂王浆的稀释液将精液稀释至8倍,0.00%蜂王浆组为对照组,置于5℃保存。在保存0、24、48、72 h利用计算机辅助精子分析系统、低渗膨胀实验、双荧光探针和Western Blot分别检测精子运动参数、质膜完整性、线粒体活性以及糖转运蛋白GLUT 3和GLUT 8丰度。结果表明：在低温保存72 h时,0.75%蜂王浆组精子的活率、活力、直线运动速率、路径速度、曲线运动速率、质膜完整性和线粒体活性均显著高于对照组。WesternBlot结果显示精子GLUT3和GLUT8丰度均随保存时间延长而降低,保存72h时GLUT8的丰度显著低于0 h;保存72 h时0.75%蜂王浆组GLUT 3和GLUT 8丰度显著高于对照组。综上,在稀释液中添加0.75%的蜂王浆可有效提高低温保存绵羊精子的质量,这与精子GLUTs蛋白表达和精子能量代谢密切相关。     

Mito-tempo对绵羊精液低温保存效果的影响

实验旨在探究不同浓度的Mito-tempo对绵羊精液低温保存效果的影响。采集8只湖羊种公羊精液,分别用含0、15、30、45、60μmol/L Mito-tempo稀释液进行8倍稀释,5℃冷藏120 h。分别在24 h和120 h检测精液品质指标（活力、活率、平均路径速度、曲线运动速度、直线运动速度、质膜完整性、顶体完整性、DNA完整性和线粒体活性）及抗氧化指标（总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量）。结果表明：在低温保存期间,30μmol/L Mito-tempo处理组精子活力、活率、平均路径速度、DNA完整性、顶体完整性、线粒体活性、超氧化物歧化酶含量和总抗氧化能力均高于对照组及60μmol/L Mito-tempo处理组（P<0.05）;在低温保存过程中,30μmol/L Mito-tempo处理组丙二醛含量低于对照组和其余各试验组（P<0.05）。由此可见,在稀释液中添加30μmol/L Mito-tempo可有效提高低温保存后绵羊精液质量。     

不同稀释液成分对绵羊精子低温保存效果的影响

本实验旨在探究一种更为高效可行且有利于绵羊精液在 4℃条件下延时保存的稀释液配方。采用含有不同成分及含量脱脂牛奶、维生素 A、维生素 D、维生素 E 等物质的 6 个稀释液配方稀释精液,每隔 6 h 测定稀释后精液中精子的畸形率、死亡率、活力以及运动速率,持续检测 96 h。结果表明:72 h 时配方四稀释液稀释后精子畸形率为 15.89%、死亡率为 48.52%、活力为 41.05、运动速率为 42.10 μm/s,精子畸形率和死亡率极显著低于其他 5 个稀释液配方(P<0.01),精子活力和运动速率极显著高于其他 5 个稀释液配方(P<0.01);通过测定分析,配方四精液稀释液中添加脱脂牛奶、维生素 A、维生素 D、维生素 E、卵黄、恩诺沙星、双抗和高浓度柠檬酸钠有助于提高精子活力和保存时间,筛选出的最佳精液稀释液配方操作过程简便有效,快速可行,精液保存 48 h 后精子活力达 68.17%,可用于绵羊人工授精。     

低温保存对绵羊精子运动参数与线粒体活性和抗氧化水平的影响

低温造成的氧化损伤是精液品质下降的主要原因。本试验旨在研究4℃低温保存对绵羊精子运动参数、线粒体活性和抗氧化水平的影响。采集3只杜泊公羊的精液,使用常规卵黄稀释液进行8倍稀释后放入4℃冰箱保存,分别在0 h、24 h、48 h和72 h后检测精子运动参数和抗氧化水平。结果表明,随着保存时间的延长,精子活率和运动参数逐渐下降,但72 h后精子活力仍保持在50%左右,活率高于70%;GSH-Px酶活性和T-AOC逐渐降低,MDA逐渐升高,72 h后精子线粒体活性显著低于0 h,但与48 h相比差异不显著。研究表明,精液在低温保存72 h后,其质量、抗氧化水平和线粒体活性均会显著下降,可以考虑在这个时间段加入线粒体靶向抗氧化剂,以延长精子的保存时间,减缓精液品质下降程度。     

去甲肾上腺素和睾酮对低温保存犬精子的影响

本试验就去甲肾上腺素和睾酮对低温保存犬精子的影响液进行了研究。试验结果表明：①稀释液—Tris-葡萄糖稀释液（Tris3．04％,柠檬酸1．7％,葡萄糖1．25％,卵黄20％）中加入去甲肾上腺素后,犬精液低温保存的效果显著优于对照稀释液和加入睾酮的稀释液,在4℃保存4d后,加入去甲肾上腺素的稀释液中的精子活率高达0．6500-0．01378,精子活率〉0-3的存活时间达8．3333&#177;2．5819d,而对照稀释液和加入睾酮的稀释液中的精子活率分别只有0．45&#177;0．16和0．36&#177;0．11,精子活率〉0．3的存活时间分别为5．67&#177;1．75和4．67&#177;1．03。②对去甲肾上腺素的不同的4种添加剂量研究后发现,100μL稀释液中加入15μL去甲肾上腺素时犬精子低温保存的效果最好。     

烟酸通过降低氧化应激水平提高绵羊精子低温保存效果

低温保存可有效延长精子体外保存时间,提高精液利用效率。但是长时间处于低温环境下会造成活性氧(reactive oxygen species, ROS)持续累积,诱发精子氧化应激,降低质膜完整性,造成精子活力下降。旨在研究绵羊精子4℃保存条件下,稀释液添加不同浓度烟酸(nicotinic acid, NA)对精子的保存效果,并探讨其作用机理。采集健康的成年德国美利奴种公羊精液(n=6),以基础稀释液中添加5、10、20 mmol·L^-1 NA为保护剂,拟阐明NA对绵羊精子的保护作用。通过精子分析仪检测精子活力、运动性能,精子低渗膨胀试验检测质膜完整性,荧光染色检测精子中ROS水平、线粒体功能,试剂盒检测H₂O₂含量、抗氧化因子活性水平及ATP水平。结果表明：与10%BSA对照组相比较,添加NA处理后精子的存活时间可延长至120 h,其中10 mmol·L^-1 NA NA处理后第72小时精子活力仍可达到70%以上;在NA处理后24～72 h时,绵羊精子可保持更高的活力、运动性能与及质膜完整性(P<...     

添加牛磺酸和黄芪多糖对羊精子低温保存的影响

为了研究羊精子低温保存时牛磺酸和黄芪多糖对精子质量的影响,本试验在BTS(Beltsville thawing solution)精液稀释液的基础上添加牛磺酸和黄芪多糖,随后对4℃低温保存条件下羊精子的精子活率、质膜完整率和顶体完整率进行考察,采用两因素五水平的中心设计法优化精子稀释液添加牛磺酸和黄芪多糖的浓度,并进一步验证经优化缓冲液的保护效果。结果显示,牛磺酸和黄芪多糖的最优添加浓度分别为27.83 mmol/L和346.91 mg/mL;采用该添加浓度能显著提高低温保存后羊精子的精子活率、质膜完整率和顶体完整率(P<0.05)。结果表明,牛磺酸和黄芪多糖对低温保存羊精子具有显著的保护作用。     

绵羊精子磷代谢的研究

经过对绵羊精子磷代谢的初步研究证明，无机磷在精子的代谢中起重要作用，要提高并维持精子较高的活力，可以采用物理手段，或稀释液中加入某种化学物质（如肌肽）以促进精子的代谢活动，从外界摄取较多的无机磷，合成了ＡＴＰ供给精子活动所需要的能量。     

钙离子浓度对绵羊精子获能的影响

为探讨钙离子浓度对绵羊精子获能的影响,将绵羊精子在不同钙离子浓度的绵羊输卵管合成液（SOF液）中培养,并用钙离子载体A23187进行诱导。结果发现,不同钙离子浓度对绵羊精子的影响差别不明显,经A23187诱导后,1.7 mmol/L组和2 mmol/L组的顶体反应率（AR）与其他组有显著差异（P<0.05）,1.7 mmol/L浓度中,绵羊精子存活时间为16 h,2 mmol/L浓度中的存活时间为10 h,因此认为绵羊精子获能的适宜钙离子浓度为1.7 mmol/L,且获能过程中钙离子的存在是必要的。     

不同生殖周期的绵羊生殖道不影响绵羊精子获能

了解发情期、妊娠前期、发情间期的生殖道对获能的影响,从而选取一个适当时期的生殖道作为实验的基础,希望能为体外获能的研究提供一些参考。将离心后的绵羊精液输入发情期、妊娠前期、发情间期的绵羊生殖道作用一定时间后,发现获能的比例均会增加,但不同时期的生殖道间差异不显著,且顶体反应的比例变化也不大;说明处于不同生殖周期的绵羊生殖道对绵羊精子获能的影响是相同的。     

哺乳动物冻融精子质膜检测方法研究

为了研究哺乳动物冻融精子质膜检测方法,试验采用降低或抑制精子新陈代谢程度以达到延长精子的体外保存寿命的方法.结果表明:经冷冻保存后,精子的活率及质膜的完整性等受到损伤,致使精子的受精能力相应下降.有研究发现,精子活率与受孕率的关系不密切,冷冻造成的精子结构和功能的变化才是导致受孕率降低的根本原因,因此进行精子质膜完整性...     

不同稀释液低温保存对公鸡精子存活时间和生存指数的影响

试验观察了3种稀释液在低温(0～5℃)环境中的保存效果,通过分析不同稀释液对种公鸡精子存活时间及其生存指数的影响,旨在筛选出保存效果最好的稀释液。结果表明:由果糖、谷氨酸钠、K_2HPO_4、KH_2PO_4配制而成的稀释液C低温保存条件下精子的存活时间达到159.5 h,生存指数为83.95,有效存活时间为5 d,显著高于由果糖、谷氨酸钠、柠檬酸钠配置而成稀释液A和醋酸钠、柠檬酸钠、Na_2HPO_4·12H_2O配制而成的稀释液B的保存效果(P0.05),在3种稀释液中保存效果最好。     

不同发情阶段的绵羊血清对绵羊精子获能和体外受精的影响

为比较不同发情阶段和不同浓度的绵羊血清在绵羊体外受精过程中对绵羊精子体外获能及存活时间、受精效果的影响,试验以绵羊输卵管合成液(SOF)为基础获能液,在其中分别添加发情当天、发情结束和发情间期的绵羊血清,血清浓度分别为0%、2%、5%、10%和20%.利用金霉素荧光染色(CTC,chlortetracycline)法及体外受精2种方法检测不同血清及其浓度对绵羊精子获能的影响.结果表明:1)当在获能液中添加发情当天绵羊血清时,在10%和20%血清浓度下作用45 min的获能效果最好,其获能而且未完成顶体反应的精子率(45.28%和44.52%)显著高于0%、2%和5%血清浓度组(30.14%、28.71%和35.49%,P<0.05);2)当在获能液中添加发情结束时或发情间期的绵羊血清时,在含不同浓度的这2种血清的获能液中作用45 min后,各浓度组引起的获能精子百分率变化均不显著(P>0.05);3)在含20%发情当天绵羊血清的获能液中,精子的存活时间(18 h)显著高于含20%发情结束和发情间期的绵羊血清的获能液(11 h;11 h);4)在不同血清诱导获能后进行的体外受精的试验中,添加发情当天绵羊血清组的卵裂率和囊胚率(62.5%和26.25%)均显著高于发情结束时血清组(42.22%和11.11%,P<0.05)和发情间期血清组(37.36%和15.38%,P<005).以上结果表明:在进行绵羊体外受精试验中,采用20%发情当天绵羊血清作用45 min比采用发情结束和发情间期的绵羊血清能更好地诱导精子获能.     

添加低剂量大豆卵磷脂稀释液低温保存绵羊精液的优化研究

本实验旨在探讨添加低剂量大豆卵磷脂稀释液对绵羊精液低温保存效果。实验一采用6个浓度(0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%)大豆卵磷脂替代TRIS专利稀释液中卵黄低温保存绵羊精液,在第0、1、4、7、10、12、18天检测精子活率、顶体完整率;实验二选用实验一中最优添加组(0.5%组)和TRIS专利稀释液制成粉剂低温保存绵羊精液,在保存第0、1、4、7、10、12天对精子活率和顶体完整率进行测定,并在保存第10天对绵羊进行人工授精。结果表明:实验一中,0%组从第1天精子活率低于其他组(P<0.05),0.25%组精子活率观测值从第10天开始低于0.25%以上浓度组(P<0.05),0.5%、0.75%、1.0%、1.25%组保存第10天精子活率均大于50%,0.5%组保存第18天精子活率高于1.0%、1.25%组(P<0.05);各组顶体完整率缓慢下降,各时间点均无显著性差异;实验二中,0.5%组与TRIS组在各时间点的精子活率、顶体完整率与受胎率均无显著性差异,保存第10天精子活率均高于50%;0.5%组受胎率为65.49%,略低于TRIS组67.65%(P>0.05)。本实验条件下,绵羊精液低温保存稀释液中添加0.5%大豆卵磷脂替代卵黄效果最佳。