两种滑刃亚目线虫的ITS-PCR-RFLP研究

采用ITS区通用引物对阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus arthuri)和燕麦滑刃线虫(Aphelenchusavenae)的基因组DNA进行PCR扩增,对其PCR扩增产物进行序列测定分析,同时用5种限制性内切酶(RsaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和AluⅠ)对PCR扩增产物进行酶切,得到相应酶切图谱。两种线虫的DNA序列测定分析以及ITS-RFLP酶切图谱得到的鉴定结果与形态鉴定结果一致。试验得到的阿苏里伞滑刃线虫和燕麦滑刃线虫ITS-RFLP酶切图谱可以为线虫的分子鉴定提供参考。     

广州白云机场口岸入境海鱼感染 异尖线虫鉴定研究

对2012—2015年从白云机场口岸入境的214批海鱼进行剖检鉴定异尖线虫,取内脏和鱼肉进行酶消化,在10批次海鱼中分离出虫体,用苯酚乳酸透明液进行透明处理及形态学鉴定,确定所分离出的虫体有异尖线虫三期幼虫Ⅰ型和Ⅱ型。用线虫rDNA ITS区通用引物NC5和NC2对虫体进行PCR扩增,并对虫体的核糖体基因间隔区ITS1和ITS2进行序列和进化分析,确定分离出来的异尖线虫三期幼虫包括简单异尖线虫(Anisakia simple)、抹香鲸异尖线虫(Anisakia physeteris)和典型异尖线虫(Anisakia typica)。调查结果对公共安全的风险评估有重要意义,同时为口岸的进境水产品食品安全风险评估提供参考数据。     

进境黄盖鲽鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以俄罗斯进境的冻黄盖鲽鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2 PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,并进行克隆,转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为1 034 bp。包含部分的18S、28S及全部的ITS1(431 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(349 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank已登记的Hysterothylacium aduncum同源性均在99.5%以上,与其他科线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从黄盖鲽鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与H.aduncum处于同一分支。研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

西班牙根结线虫rDNA特性及其检测方法

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带.表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫.     

西班牙根结线虫rDNA特性及其检测方法

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带.表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫.     

腐烂茎线虫种内群体特异性检测研究

对腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)7个不同地理群体rDNA 中的ITS区进行PCR-RFLP和序列测定, 发现种内群体间无论在序列长度还是酶切图谱均存在一定的变异.根据其序列特征设计出种特异性引物, 对所供试的腐烂茎线虫群体及属间不同种群体样品的rDNA ITS区相应区段扩增以验证其特异性, 同时对分别由1～5条腐烂茎线虫成虫和幼虫提取的DNA进行特异性扩增以验证其灵敏度. 结果表明: 所有供试的腐烂茎线虫群体均可以特异性扩增一个346 bp的片段, 而所有供试的属外种均没有扩增片段;由1～5条腐烂茎线虫成虫和4～5条幼虫进行的特异性扩增也获得稳定的目的片段. 显示该特异性引物具有较高的稳定性、特异性和灵敏度, 能快速、准确地检测出腐烂茎线虫.     

江苏省小麦禾谷孢囊线虫群体核糖体DNA-ITS区序列分析

对采集自江苏省徐州、宿迁、连云港和盐城4个地区的15个小麦禾谷孢囊线虫群体进行核糖体DNA-ITS区的RFLP分析。结果表明:测定的所有群体均具有相同的酶切图谱,既具有与国外B型群体(印度群体)相同的AluⅠ和RsaⅠ酶切图谱,同时也具有中国群体独特的HinfⅠ和Tru9Ⅰ酶切图谱(C型)。采用Neighbor-Joining法(MEGA4.0)构建的ITS序列系统进化树显示:所有15个江苏群体均聚在小麦禾谷孢囊线虫组(Heterodera avenae group)下的小麦禾谷孢囊线虫复合种群(H.avenae complex)分支内,且多数江苏群体与草地孢囊线虫(H.pratensis)德国和俄罗斯群体的遗传距离相对较近。通过江苏群体与其他近源群体的ITS序列分析比较,河南郑州群体与澳州孢囊线虫(H.australis)的遗传距离较近,青海群体和河南郑州群体在分子遗传水平上具有明显的地域性,而江苏省和我国其他省份的小麦孢囊线虫群体具有丰富的遗传多样性。     

利用rDNA的PCR-RFLP对伞滑刃属线虫群体的分子鉴别

应用对rDNA中ITS的PCR-RFLPs技术和方法对来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃属(Bursaphelenchus)6个线虫群体进行了分子鉴定.其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫(B.xylophilus),而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一个群体等4群体被鉴定为拟松材线虫(B.mucronatus).本研究中选用的4种限制性内切酶(Hinf Ⅰ、Hae Ⅲ、MspⅠ、cfo Ⅰ)的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫.     

用PCR-RFLP技术鉴别鲁道夫对盲囊线虫姊妹种的研究

用保守引物扩增鲁道夫对盲囊线虫Contracaecum rudolphii姊妹种和C．septentrionale rDNA第一内转录间隔区(ITS-1)片段并纯化,根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B和C．septentrionale rDN ITS-1序列,选用限制性内切酶Msp Ⅰ和Nsi Ⅰ酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析．结果经Msp Ⅰ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫姊妹种与C．septentrionale表现出不同的条带;经Nsi Ⅰ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫B和C．septentrionale结果一致,与鲁道夫对盲囊线虫A不同．用MspI可以鉴定出C．septentrionale,用Nsi Ⅰ可以鉴定出鲁道夫对盲囊线虫A,2个限制性内切酶合用可以将鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C．septentrionale分别鉴定出来．根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C．septentrionale rDNA ITS-1基因序列建立的鲁道夫对盲囊线虫姊妹种PCR-RFIP鉴别技术能够对鲁道夫对盲囊线虫姊妹种进行准确、特异和简便的鉴别．     

土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)的菌种鉴定及其遗传多样性的初步分析

 【目的】鉴定外生菌根真菌土生空团菌（Cenococcum geophilum Fr.（Cg））菌种，分析土生空团菌的遗传多样性，探讨影响土生空团菌遗传分化的因素。【方法】采用形态特征结合PCR方法，从分离自6种寄主植物的27个中国菌株和来自法国的5个Cg菌株中鉴定出20个Cg菌株。利用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和随机扩增片断多态性DNA（RAPD）两种分子标记方法对这20个Cg菌株进行遗传多样性分析。【结果】PCR-RFLP方法以通用引物ITS1和ITS4对20个Cg菌株的核糖体DNA转录间隔区（ITS）进行了PCR扩增，扩增产物用3种内切酶（EcoRⅠ、HinfⅠ和MboⅠ）酶切，酶切图谱显示菌株间有明显差异。RAPD方法用经过筛选的随机引物（5'-CGCACCGCAC-3'）对20个菌株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物的片段大小在300～2 000 bp范围之间，共产生19个多态性位点。根据电泳图谱上DNA带的数目、位置及强度进行数值化，用聚类分析软件计算菌株间的遗传距离和遗传相似性，根据遗传距离构建20个菌株的系统聚类图。【结论】来源于不同寄主及地域的20株Cg有着较丰富的遗传多样性；地理环境和寄主对Cg遗传多样性的影响不大。     

运用PCR-RFLP标记检测南瓜疫病菌

用 1对特异引物对南瓜疫霉菌 (Phytophthora capsici)及疫霉属 (Phytophthora)部分真菌和常见土传真菌12个种的 14个菌株的 18s r DNA(即 Small Subunit Ribosom al DNA)进行扩增 ,用 4种限制性内切酶 (Eoo R 、Hae 、Hha 、Hinf )酶切 PCR扩增产物 ,分析各菌株间的 DNA限制性片段多态性 ,首次建立了南瓜疫霉菌的PCR- RFL P检测程序。并运用该 PCR- RFL P检测程序对染病南瓜植株进行检测 ,成功地在南瓜植株发病茎病健交界处、发病叶病健交界处、发病果病健交界处、接种 2 4 h的叶和接种 P.capsici 12 h的茎上快速、准确地检测到了南瓜疫病菌的存在。     

Identification and Preliminary Analysis of the Genetic Diversity of Cenococcum geophilum Fr.

To identify Cenococcum geophilum Fr., estimate their genetic diversity and study the effects on their genetic variation, 27 Chinese C. geophilum isolates from 6 host plant species and 5 French C. geophilum isolates were analyzed using morphological and molecular methods. The universal primers ITS1/ITS4 were used in PCR-RFLP to amplify the rDNA internal transcribed spacer （ITS） of tested C. geophilum isolates. The amplified products were digested with EcoR Ⅰ, Hinf Ⅰ, and Mbo Ⅰ, and the digested fragments of PCR products showed that there were obvious differences. A random primer （5′-CGCACCGCAC-3′） was employed in RAPD to amplify the genomic DNA of C. geophilum, and 19 detectable and reliable DNA bands of 300-2000 bp size were observed. According to the number, position, and strength of the DNA bands in agarose gel, the genetic distance and the genetic similarity among C. geophilum isolates were calculated using the PopGen Ver. 1.31 dendrogram analysis software. A phylogenetic tree was constructed based on the genetic distance by the Neighbor-Joining/UPGMA in PHYLIP. The results suggest the high level of genetic diversity among C. geophilum isolates from the same or different hosts. The effects of geographical factors or host plant species on C. geophilum genetic variation are not obvious.     

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA (ribo-somal DNA,rDNA)的ITS( internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性.利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rDNA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段.ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(＞0.60)聚为一类,具有较近的 亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.     

湖北白猪及其杂交后代H-FABP基因型与相关性状关系研究

 【目的】对湖北白猪及其杂交后代H-FABP基因多态性以及与生产性状的相关进行分析,为在湖北白猪优质系培育过程中进行分子标记辅助育种提供理论基础。【方法】采用PCR-RFLP（HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ）方法分析湖北白猪及其杂交后代共计282头猪的H-FABP基因5′-上游区域和第二内含子遗传多态性,利用最小二乘模型分析杂交后代H-FABP基因型对相关生产性能的影响。【结果】湖北白猪在HinfⅠ-RFLP位点表现为单态,在HaeⅢ- RFLP和MspⅠ-RFLP位点上呈现多态,杂交一代、杂交二代在三个酶切位点均呈现出多态;湖北白猪在HinfⅠ-RFLP、HaeⅢ-RFLP位点均表现为低度多态,在MspⅠ-RFLP位点表现为中度多态,其杂交一代、杂交二代均表现为中度多态;不同基因型对IMF（Intramuscular fat,肌内脂肪）含量的影响,HH＞Hh＞hh,dd＞Dd＞DD,aa＞Aa＞AA,dd 基因型IMF含量显著高于DD、Dd基因型（P＜0.05）,aa、Aa基因型IMF含量极显著高于AA型（P＜0.01）。HH基因型20日龄重显著高于hh基因型（P＜0.05）。其它生产性能在不同基因型间差异不显著（P＞0.05）。【结论】在选育群体中可以通过选择H-FABP的优势基因型（aa- dd- HH）提高IMF含量而不影响其它生产性状。     

攀西地区葛藤根瘤菌的RFLP遗传多样性

利用16S rDNA PCR-RFLP和16-23S IGS PCR-RFLP技术对分离自四川攀枝花的43株葛藤根瘤菌进行了遗传多样性研究。供试菌株的16S rDNA用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ酶切后具有16种遗传图谱类型。16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析结果表明,在53%的相似性水平上,供试菌株与参比菌株分为两个分支,在81%的相似水平上所有菌株分为13个群。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

葡萄金黄化植原体16SrDNA检测与RFLP分析

[目的]对多种植原体16SrDNA基因序列进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析比较,以期区分葡萄金黄化植原体不同亚种,从而为葡萄金黄化植原体的鉴定提供新依据.[方法]用植原体通用引物R16mF2/R16mR1扩增7种不同植原体16SrDNA基因序列,得到约1.5 kb的DNA片段,将此片段克隆到PGM-T载体,并通过酶切鉴定,对重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性分析,利用限制性内切酶XmnⅠ、XspⅠ、TaqⅠ和Rsa Ⅰ对目的片段进行酶切电泳分析.[结果]所扩增2个不同亚种的葡萄金黄化植原体D型和C型序列同源性最高,达99.72;,但利用限制性内切酶可以将上述2个亚种从植原体榆树黄化组中区分.[结论]利用限制性内切酶分析通用引物R16mF2/R16mR1所扩增的基因片段,可以将葡萄金黄化植原体区分.     

丝克高粱rDNA ITS区的RFLP分析

对检疫性杂草丝克高粱及其5个同属近似种假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草和黑高粱的rDNA内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增及测序,并利用限制性内切酶XceⅠ对这些近似种的PCR产物进行酶切分析.结果表明:各个种间均有XceⅠ酶切位点,其中假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草及黑高粱5个种的酶切图谱完全一致,而丝克高粱的酶切图谱与其5个同属近似种的酶切图谱不同.假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草及黑高粱的rDNA PCR扩增产物可以切出4条带,大小约为670、530、190、150 bp;而丝克高粱只能切出2条带,大小约为670、190 bp,这与其5个同属近似种在rDNA ITS区有2个XceⅠ酶切位点,而丝克高粱只有1个酶切位点的结果相一致.因此,利用XceⅠ就可以把丝克高粱与其5个近似种区分开.