柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

紫心甘薯IbCHS基因启动子的克隆及功能分析

利用hi Tail-PCR从紫心甘薯‘A5’基因组DNA中扩增得到查尔酮合成酶IbCHS基因5'端上游2470 bp的一段序列,用PlantCARE软件序列分析表明,该序列含有启动子基本元件CAAT-box和TATA-box,还有赤霉素应答元件、光应答元件、MYB和bHLH转录因子结合元件,初步推测其为IbCHS基因的启动子,命名为PIbCHS基因启动子。将PIbCHS启动子从5'端进行截短克隆,得到了4个长度不同的启动子5'缺失片段,由长到短分别命名为PS1、PS2、PS3和PS4。分别构建了PIbCHS、PS1、PS2、PS3和PS4驱动GUS基因的真核超表达载体,瞬时转化烟草叶片发现,PIbCHS、PS1、PS2、PS3均有启动子活性,但是PS4不能驱动GUS基因的表达,说明PIbCHS启动子的驱动核心区域主要位于PS3和PS4之间的部位。稳定转化拟南芥表明,PIbCHS能够启动GUS基因的表达。     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆与功能分析

从拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA中扩增出热激启动子AtHSP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子AtHSP70b插入到pSAU2008的gus基因及NOS终止子上游,构成热激启动子控制GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入到pVCT2020中得到表达载体pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404,并转化烟草(W38)获得再生植株,通过PCR检测鉴定,表明“AtHSP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价

RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥RBCS-1A受光调节表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受光诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件; 采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1 691 bp的AtRBCS-1A启动子片段, 将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥, 对获得的转基因植株进行GUS染色, 结果显示, AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行, 具有重要应用价值。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

棉花种子特异表达α球蛋白A基因启动子的功能分析

研究植物种子特异启动子具有重要的理论和实际意义。本文研究了棉花α球蛋白A基因启动子,该启动子序列全长为1640 bp,作用元件分析表明该区域除了具有核心调控序列外,还含有多个与组织特异性相关的顺式作用元件。设计其5'端构建4个不同长度的缺失、融合GUS基因的表达载体,并通过蘸花法分别转化拟南芥。转基因拟南芥GUS表达分析结果表明,该启动子能驱动GUS基因在胚、露白的种子、子叶期的幼苗中表达,而二叶期的幼苗、根、茎、莲座叶、茎生叶和花苞组织则没有表达,说明棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子。208 bp长度的启动子足以维持其种子特异表达功能,而且在启动子的-684和-208区域之间可能存在负调控元件或负调控区域。分析棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子,其基本启动子区域不长于208 bp。     

棉花种子特异性启动子的克隆及表达载体构建

种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具.Lea(Late embryogenesis abundant)蛋白是胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,因此,其调控序列可能提供一个很好来源的种子特异性表达启动子.为研究植物Lea蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,本研究通过PCR扩增,从亚洲棉(Gossy...