大豆热激蛋白基因HSP17.4的耐热功能鉴定

为研究小热激蛋白基因HSP17.4在大豆热生物胁迫耐受过程中的作用,本试验把植物过表达载体p CPB-HSP17.4和RNA干扰表达载体p CPB-HSP17.4-RNAi利用农杆菌介导法将其导入受体大豆JN18中。经PCR检测,获得T0代阳性植株13株;T1代阳性植株26株;T2代阳性植株39株。T1、T2代转基因植株Southern blotting结果显示,目标基因以单拷贝形式整合到基因组中。荧光定量PCR结果显示,HSP17.4基因在转化植株的叶、茎中均有表达。在42℃高温胁迫下,与未转化植株相比,T1、T2转过表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的813%和793%,转RNAi表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的49.77%和52.81%。耐高温鉴定结果表明,转过表达HSP17.4基因提高了植株的耐高温能力。     

沙田柚热激蛋白HSP90基因的鉴定分析

为探明沙田柚自交不亲和分子机理,以沙田柚(Citrus grandis var.Shatianyu Hort)自交和异交花柱为材料,对其进行转录组测序;通过差异分析获得相关基因,并研究其理化性质。结果表明:获得的Hsp90基因全长2 602bp(GenBank登录号:KU517851),开放阅读框(ORF)全长为2 100bp,编码699个氨基酸,编码的蛋白质分子量为80.55KDa,理论等电点为5.01,含有1个与HSP90超家族(HSP90superfamily)相同的保守结构域。沙田柚Hsp90蛋白氨基酸的同源性与甜橙(XM_006490568)、克莱门柚(XM_006421973)亲缘关系较近,同源性高达99%,属同一进化分支。     

药用植物川续断热激蛋白基因HSP70和HSP90的鉴定与分析

为了解药用植物川续断中热激蛋白基因的分布情况及序列特征,以不同海拔川续断转录组数据库为基础,利用生物信息学方法鉴定和分析川续断HSP70和HSP90基因家族成员。结果表明,川续断中至少包含36个HSP70和18个HSP90基因,各成员在细胞质、细胞核、内质网中均有分布,15类保守基序长度介于15～50个氨基酸之间;系统进化树揭示DaHSP90基因与拟南芥亲缘关系更近。初步筛选了10个响应温度胁迫的热激蛋白基因,为进一步探索川续断HSP基因家族的功能奠定重要理论基础,同时也为研究影响其活性成分川续断皂苷Ⅵ含量因素提供参考。     

大豆热激蛋白Hsp90家族基因鉴定及分析

热激蛋白Hsp90是广泛存在于微生物和动植物体中高度保守蛋白质之一,大量研究发现其参与生物体应答应激反应、信号转导、细胞周期调控、蛋白降解及转运等生理活动,具有重要研究价值,因此在许多物种中热激蛋白Hsp90基因家均被广泛关注和研究.但大豆中Hsp90基因家族详细信息尚不清楚,研究通过生物信息学分析发现共有13个Hsp...     

仙客来热激蛋白基因HSP21.4植物表达载体构建及鉴定

试验以仙客来热激蛋白基因HSP21.4为材料,经PCR扩增的方法在目的片断两端添加SacⅠ位点,然后与植物表达载体pBI121连接,转化感受态大肠杆菌,经PCR和SacⅠ及XbaⅠ酶切验证,确定已将该热激蛋白基因连接到植物表达载体上,将重组质粒命名为pBI-CpHSP21.4,并采用冻融法完成了对pBI-CpHSP21.4质粒的农杆菌转化,为验证该热激蛋白基因的功能及转基因植物表达奠定基础。     

美国白蛾热激蛋白家族基因的筛选与鉴定

热激蛋白(Heat shock protein,HSP)一般是指生物体遇到极端环境时大量表达的一类高度保守基因,在昆虫的抗逆性反应中发挥重要作用。以世界性入侵害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)基因组数据为依据,对白蛾的HSP家族基因进行筛选与鉴定。结果表明:美国白蛾体内共有20个HcunHSPs,包括8个HSP20s、7个HSP40s、4个HSP70s和1个HSP90;结合美国白蛾12个转录组中上述HSPs的表达量及鳞翅目中已有相关基因的功能研究,对HcunHSPs功能进行了初步预测。研究结果可为后期对美国白蛾抵抗逆境胁迫机制研究提供分子理论基础,为针对美国白蛾的绿色防控提供基因靶标和新思路。     

大豆HSP20基因的鉴定及表达分析

HSP20是一种小分子热激蛋白,在植物生长发育和抗胁迫过程中发挥重要作用.研究利用生物信息学方法对大豆中56个GmHSP20家族基因进行了鉴定,并对其理化性质、基因结构、进化关系、启动子原件以及表达模式进行了分析.56个家族基因分为11个亚族,分布在18条染色体上;氨基酸长度不一、分子量和等电点变化范围比较大;启动子原...     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2互作调控其酶活性

【目的】为探究拟南芥小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2的关系。【方法】构建带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4的原核蛋白表达载体,将小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2的重组蛋白诱导表达后进行体外免疫共沉淀试验,并利用过氧化氢酶活性试剂盒检测过氧化氢酶活力。【结果】成功构建了带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4的蛋白表达载体,并通过体外免疫共沉淀试验发现带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4能够将无纯化标签的过氧化氢酶2成功纯化出来,过氧化氢酶活性检测表明小热休克蛋白HSP17.4可以显著增强过氧化氢酶2活性。【结论】本研究证明小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2存在相互作用,并且小热休克蛋白HSP17.4激活过氧化氢酶2酶活性,为进一步研究小热休克蛋白HSP17.4通过调控过氧化氢酶2参与非生物胁迫响应奠定基础。     

试析小麦耐热性鉴定及热激蛋白基因的克隆与表达

<正>前言:小麦是中国粮食作物之一,小麦在生长季节时常常受到异常高温天气造成高温胁迫影响,从而导致小麦的产品和品质逐渐下降。中国历来是农业大国,大力发展农业也一直是国家的基本国策之一,近年来,通过国家的重点扶持和广大农民朋友的不懈努力,在农业上取得了非常显著的发展。然而,近年来,随着全球变暖的原因,对农作物的正常生长影响很大,让人们不得不重视起来。本文围绕河南农作进行分析与讨论,研究高温胁迫对小麦耐热性的影响,探讨小麦耐热的生理机     

家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

【目的】 HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】 利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术（LC-MS/MS）,首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】 免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated（IP）用α-Flag抗体孵育,immunoblotting（IB）再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】 鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。      

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提...     

植物小热激蛋白及其生物学功能研究进展

植物中的小热激蛋白(sHSPs)含量丰富,种类繁多。除高温外,sHSPs还被其他多种胁迫诱导,亦能受植物正常发育过程调控。sHSPs由核基因编码,其典型特征是有1个保守的α-晶状体蛋白域结构。通常植物sHSPs具有分子伴侣功能,在不依赖ATP的情况下阻止变性蛋白的聚集,从而对植物抵抗、适应胁迫环境以及生长发育起着重要作用。文章对植物中sHSPs的种类、蛋白结构特征和生物学功能进行了综述。     

植物内质网小分子量热激蛋白的生物学功能

介绍了植物ERs HSP的结构特点、分子伴侣活性及逆境抗性等生物学功能,并展望了该领域今后的研究方向,为深入研究植物的逆境胁迫机制以及分子水平的作物育种提供了新思路。     

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。     

植物热激蛋白研究进展

热激蛋白是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白, 是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分, 对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用 有机体在受到逆境胁迫后, 体内变性蛋白急剧增加, 热激蛋白可以与变性蛋白结合, 维持它们的可溶状态, 在有Mg2+和ATP的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象 文中主要综述和讨论植物热激蛋白的产生与类型、存在与定位, 论述了热激反应的特点、基因表达调控及其功能的研究进展, 并提出热激蛋白与树木耐旱性关系的研究展望