兔病毒性出血病病毒VP60蛋白基因研究进展

兔出血病病毒(RHDV)是引起兔病毒性出血病(RHD)的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对VP60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

新型兔出血症病毒与经典型病毒的差异

新型兔出血症病毒(RHDV2)在全球范围流行并已在我国出现,给养兔业带来巨大威胁.为了解RHDV2与经典兔出血症病毒(RHDV)的异同,从病原学、流行病学、临床症状、致病机理、诊断与防控等方面,阐述了两种病原的不同及相关研究的最新进展.对比发现:RHDV2与经典RHDV亲缘关系较远,抗原表位也存在明显差异,属于不同的病...     

含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究

为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,血清RHDV HI效价为1∶16～1∶64,攻毒后免疫兔均健活(5/5);免疫后21 d,用Pm和Cp分别攻毒,免疫兔80%以上(4/5～5/5)保护;免疫持续期可达210 d。RHDV VP60蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗,解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题,同时实现了一针三防。     

貂肠炎病毒DNA探针打点杂交技术检测兔出血症病毒

采用HindⅢ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术,从重组质粒pBM中回收0.7kb貂肠炎病毒(MEV)DNA片段.以[α-~(32)P]dATP和光生物素分別标记制备DNA探针。采用打点杂交技术,用上述探针检测提纯的兔出血症病毒(RHDV)和3份感染RHDV的兔肝脏样品,同时检测从貂、犬、豹、猫和貉分离的5种肉食兽细小病毒,并用电镜检查和血凝试验为对照。探针与上述5种肉食兽细小病毒呈杂交阳性反应,而RHDV及感染的肝脏样品为阴性反应.该结果表明,MEV和RHDV在该0.7kb DNA区域内没有同源性,而5种肉食兽细小病毒在此区域内具有遗传相关性。     

兔出血症病毒两种感染途径的致死性比较研究

为提高猪瘟活疫苗的外源性兔出血症病毒(RHDV)的检测敏感性,进行了RHDV对家兔感染途径的致死性比较试验,以便筛选出具有较高致死性的感染途径。将RHDV通过皮下、静脉两种途径感染家兔,比较了家兔两种感染途径的半数致死量(LD_(50)),同时对1批污染RHDV的脾淋源猪瘟活疫苗采用皮下、静脉两种途径注射家兔进行RHDV检测。结果表明,静脉途径对家兔的LD_(50)是皮下途径的126倍;污染疫苗的检测应用也表明家兔感染的静脉途径比皮下途径更加敏感,提高了猪瘟活疫苗外源性RHDV污染的检出率;RT-PCR证实了注苗死亡家兔的肝脏组织含有RHDV。本试验可为《中国兽药典》的修订提供数据参考。     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

兔出血症病毒和兔细小病毒血清学关系的比较研究

为了检测兔出血症病毒和兔细小病毒的血清学关系,我们采用日本兔细小病毒(LPV)兔源抗血清和豚鼠源抗血清,分别与我国不同地区分离的8株兔出血症病毒(RHDV)抗原作常规血凝抑制试验(HIT)和间接血凝试验(IHA),结果兔细小病     

用酶切和Southern杂交鉴定兔出血症病毒核酸型

本研究组在以往的许多实验中证明,兔出血症病毒(RHDV)基因组为单股、线状DNA,但迄今仍有RHDV基因组为RNA的报道。为此,我们用酶切和Southern杂交进一步对RHDV核酸进行鉴定。取电泳纯RHDV核酸,分别用DNase和无DNase的RNase处理,与禾处理的RHDV核酸一起作琼脂糖电泳。结果,未处理的和用RNase处理的RHDV核酸均在7.0kb处出现一条清晰的核酸带;用DNase处理的RHDV核酸则被完全降解,而不出现带。将此凝胶     

ELISA双抗体夹心法测定兔出血症病毒抗原

自刘胜江等报道兔出血症病毒(RHDV)以来,国内许多学者对该病毒的各种生物学特性进行了广泛研究,并取得了显著进展。但该病毒在各脏器组织中的动态分布尚未见报道。为此,我们应用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法对其进行了研究,取     

一株兔出血症病毒变异毒株的分离与鉴定

2021年3月份河南省某养兔场肉兔疑似感染兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV),为了分离鉴定肉兔感染毒株,并对所分离毒株特性进行研究,试验对兔场送检的病死兔进行解剖、细菌与病毒分离、RT-PCR检测、纯净性检测、血凝性测定,并进一步进行半数致死量(LD₅₀)、传统疫苗免疫兔攻毒保护试验和免疫原性测定。结果表明：病死兔剖检可见肝脏、心脏、肺脏等实质内脏器官广泛出血。病料未分离到细菌,RT-PCR检测鉴定感染病毒为RHDV;用分离株注射非免疫健康家兔后,兔48 h内死亡,症状表现和剖检病变与兔出血症相似;将所分离RHDV命名为HN株,其对人“O”型红细胞无血凝性,对兔的LD₅₀为1×10^-6.77/mL;灭活后免疫兔,能抵抗RHDV HN株攻击。说明养兔场肉兔感染了RHDV,且成功分离鉴定得到一株变异型RHDV,其具有良好的免疫原性。     

兔病毒性出血症病毒西藏分离株毒力的测定

对一株兔病毒性出血症病毒(RHDV)西藏株进行血凝性、特异性、致病性及毒力鉴定。结果表明:此株RHDV血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;RHDV的最小致死量为10-5/mL。说明此分离株是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

兔病毒性出血症NB毒株的分离鉴定

<正>兔病毒性出血症(RHD)俗称"兔瘟",对之使用组织灭活疫苗,效果良好。2011年,四川省南部县某兔场曾免疫了兔瘟巴氏杆菌二联苗,后来兔场又发生了疑似RHD,为找出发病原因,我们首先对病毒进行了分离鉴定,研究RHDV是否发生了变异,以便今后能更好地防控RHD。1材料与方法1.1主要毒株与试剂RHDV疫苗毒株RHDV(AV33)组织灭活疫苗由成都川宏生物科技有限公司馈赠;RHDV(AV33)抗血清自制;人"O"型红     

兔出血症病毒西藏野毒分离株的鉴定

对西藏农牧学院分离的一株兔出血症病毒(RHDV)西藏野毒进行血凝性、特异性和致病性进行鉴定。结果表明,此株RHDV野毒血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;西藏株RHDV的最小致死量为10^-5／mL,是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化

以重组兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白为抗原，建立了RHDV抗体间接ELISA检测方法。优化的试验反应务件为：重组VP60的包被质量浓度为1．0mg／L，用10％牛血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的ELISA与现行血凝抑制(HI)试验比较发现，不同免疫状态的兔血清的RHDV ELISA抗体与HI抗体均呈正相关。对11个RHD免疫兔场1130份血清样品的抗体检测表明，各免疫兔群血清RHDV抗体水平不完全一致，D值在1．09～1．76之间，显著高于非免疫兔(0．05)及SPF兔(0．02)，低于高免兔(2．34)。在此基础上，研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒，测定了其主要指标，制定了各成分的质量控制标准，为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。     

三峡库区兔病毒性出血症流行情况调查

为了调查三峡库区兔病毒性出血症(RHD)的流行情况,在三峡库区的开县、石柱县、渝北区等养兔示范县调查20个兔场,采集疑似RHD病料32份。采用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)对病料进行检测。结果表明HA试验检测到4株兔病毒性出血症病毒(RHDV),阳性率为12.5%,HA效价为8~12 lb;这4株RHDV血凝性都能被RHDV疫苗毒株(AV33)的抗血清抑制。在RHD疫苗普免的情况下,目前库区虽然没有RHD的大流行,但仍然存在RHD的散发,应引起兽医防疫部门和养兔场的高度重视。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆及表达

兔出血症（rabbit haemorrhagic disease,RHD）是1984年由我国首先发现的家兔的一种烈性毁灭性病毒性传染病。迄今为止,本病在世界范围内广泛流行。由于RHDV在体外组织细胞的培养方法尚未建立,所以目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。这种疫苗不仅具有其自身所不可避免的种种缺陷,并且随着非免疫兔的急剧减少,组织灭活苗的成本不断增加。因此,RHDV惟一的结构蛋白-VP60的研究成为热点。VP60基因在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用,其核苷酸的极端保守性正是目前RHDV仅有一个血清型的原因所在,     

兔出血症病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。     

兔出血症病毒衣壳蛋白N端携带双串联卵清蛋白T细胞表位嵌合体的构建与表达

在兔出血症病毒(RHDV)主要结构蛋白VP60的N端插入双串联卵清蛋白(OVA)CD8+T细胞表位(OVA第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性。通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN。经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成。结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒。本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

利用毕赤酵母表达系统表达兔出血症病毒样颗粒及其免疫原性研究

为研究毕赤酵母表达的兔病毒性出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫保护性,本研究将RHDV VP60的基因克隆到pPIC3.5K载体中,并导入毕赤酵母KM71菌株中,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过western blot检测目的蛋白的表达;透射电镜观察表达产物是否组装形成VLP;并通过动物试验评估VLP的免疫原性和攻毒保护效果。Western blot结果显示VP60蛋白能够在酵母内表达,电镜下观察到表达的VP60能够自发装配成大小均一的颗粒,与天然RHDV大小相当,约为30 nm～40 nm,表明表达的VP60可以自发组装成VLP。动物实验结果表明:表达的VLP与佐剂MONTANIDE GEL 01 PR混合后免疫实验兔,能够刺激实验兔产生保护性抗体,免疫后21 d攻毒,对实验兔的保护率达100%,且保护性抗体至少可以持续6个月。本研究利用毕赤酵母表达了RHDV的VLP,为研制RHDV亚单位疫苗奠定了基础。     

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

【目的】试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。【方法】根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBac^TM Dual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。【结果】试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,...