茶树CsASR基因的克隆及其表达分析

逆境胁迫影响茶树生长发育及茶叶品质,ASR(abscisic acid,stress,ripening-induced)基因在植物抗逆响应中具有重要功能。本研究以龙井43品种茶树为材料,从中克隆了CsASR基因的全长cDNA序列、基因组序列及其启动子序列,分析了该基因的生物信息学特征及在组织间和不同胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsASR的cDNA序列全长875 bp,含有546 bp的ORF序列,编码181个氨基酸,蛋白质分子量19.89 kD,理论等电点5.69;CsASR蛋白结构序列中74.5%的序列为无序结构,是一种无序蛋白;CsASR的C-端含有ABA/WDS功能结构域,主要定位于细胞质和细胞核中;茶树CsASR与海枣的ASR相似性最高,为87%,而在进化树中与枣的关系最近。CsASR基因含2个外显子,第1个外显子长363 bp,第2个外显子长183 bp,内含子较大为2 750 bp,内含子中含7种简单重复序列和2种DNA转座子序列。克隆获得起始密码子ATG上游2 554 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。CsASR在根中的表达量最低;ABA抑制CsASR的表达,而干旱、NaCl和低温胁迫能够显著上调CsASR的表达。表明CsASR基因可能与茶树抗逆密切相关。     

马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与表达分析

WUSCHEL(WUS)基因是植物干细胞的标志基因。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到Ro WUS c DNA全长序列,采用染色体步移法克隆得到该基因的启动子序列,登录号分别为KF365488、KF861578。马银花Ro WUS c DNA全长1 123 bp,编码302个氨基酸;DNA序列2 001 bp,包含2个内含子和3个外显子;启动子序列3 122 bp。生物信息学分析表明:Ro WUS亚细胞定位于细胞核,是不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有跨膜结构,包含homeodomain功能位点。系统进化树分析结果表明:Ro WUS单独形成一个分支,与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。对Ro WUS的启动子进行分析表明,该启动子除了含有丰富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外,还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。q PCR结果表明:Ro WUS基因在马银花愈伤组织不同生长时期中呈先上升后下降的趋势,在第5个继代周期时表达量最高。外源赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时表达量最高,说明Ro WUS基因在该浓度时对赤霉素和脱落酸的响应最强。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）CHUP1基因克隆及其生物信息学分析

CHUP1(chloroplast unusual positioning 1)参与了叶绿体移动信号转导过程,对植物避免光伤害及提高光合效率方面具有重要作用,并且与植物抗寒性有密切关系.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,分离出CHUP1基因cDNA和DNA序列,GenBank登录号分别为JX123753、JX880084,命名为Mu-CHUP1.Mu-CHUP1 cDNA全长3232 bp,ORF 2931 bp,编码976个氨基酸.福州宦溪野生蕉Mu-CHUP1 cDNA序列与小果野蕉(M.acuminata,AA Group)全基因组测序中的CHUP1 cDNA序列的相似性为84.71％;福州宦溪野生蕉Mu-CHUP10RF的DNA序列含8个内含子、9个外显子,而小果野蕉全基因组测序中的CHUP1基因组DNA序列则有11个内含子、12个外显子,两者相差较大.生物信息学预测分析表明,Mu-CHUP1磷酸化位点多达62个,并且含有3个保守结构域,可能与其行使多样性的功能有关.     

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。     

番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

荔枝LcAsr基因的生物信息学分析与载体构建

根据荔枝果皮cDNA微阵列信号分析结果,对荔枝cDNA文库的BA05-H4克隆测序.NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ORF分析发现其含有1个完整的开放读码框.编码152个氨基酸残基的多肽,为一全长cDNA序列.Blastx比对分析表明该基因编码的蛋白与其它植物来源的ASR(abscisic acid,stress and ripening indueible)蛋白高度同源,该基因被命名为LcAsr,通过PCR的方法获得其DNA全长序列.生物信息学分析结果表明,LcAsr基因的DNA序列全长为1 177 bp,读码框中间包含1个488 bp的内含子.Protparam预测分析结果表明LcAsr基因编码蛋白的分子式为C756H1130N228O238S1,相对分子质量为17 252.7,等电点pI6.10,富含Glu、His、Lys、Ala.Predict protein预测该蛋白的二级结构主要是α螺旋.有1个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸盐化位点、3个豆蔻酰化位点等,并具有很高的亲水性,预测该蛋白位于细胞核.构建了植物荧光表达载体pCAMBIA-LcAsr,并通过基因枪转化法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,对LcASR蛋白进行亚细胞定位,结果表明LcASR蛋白定位于细胞核.     

大豆GmGW2基因的生物信息学分析

GW2基因在多种植物中发挥调控籽粒性状的功能,为预测分析大豆中GW2基因的功能,前期通过同源克隆的方法从大豆中成功克隆出GmGW2基因的cDNA序列。为了继续开展深入研究,本试验从大豆中黄10号中克隆出GmGW2基因的全长DNA序列并进行了较为详细的生物信息学分析。结果表明:GmGW2全长8 467 bp,包含8个外显子和7个内含子,编码431个氨基酸。预测是一个不稳定亲水蛋白,定位于细胞核或细胞质中,不含跨膜结构域及信号肽,具有Zinc finger和RING-type结构域。二级、三级结构预测分析显示,α-螺旋及不规则卷曲是其整体蛋白质结构中的主要组成结构元件。利用该基因的DNA序列,构建进化树分析得出该基因与木豆、相思子、鹰嘴豆亲缘关系较近。根据以上分析结果推测GmGW2基因可能也具有调控大豆籽粒发育的功能。此研究旨在为进一步挖掘和验证GmGW2基因功能奠定基础,为大豆产量育种工作提供有益信息。     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶基因BnCP51及其启动子的克隆与表达

为通过转基因技术建立新型授粉控制体系,克隆与雄性不育相关的基因及启动子,根据甘蓝型油菜全基因组信息设计特异引物,获得半胱氨酸蛋白酶家族基因Bn CP51的完整开放阅读框和上游启动子序列。Bn CP51基因全长1 032bp,在Gen Bank登录号KC898325,启动子长1 951bp。生物信息学分析表明,Bn CP51具有木瓜蛋白酶基因家族典型的保守结构域ERFNIN和GCNGG功能域。实时荧光定量PCR结果表明Bn CP51在花蕾中高量表达。在线启动子序列元件预测分析发现Bn CP51启动子序列中有多个花药特异表达元件。构建重组载体p Bn CP51::GUS,转化拟南芥,GUS染色结果表明在Bn CP51启动子的驱动下,报告基因GUS仅在中期花蕾和花药中特异表达,在其他组织中不表达。     

大豆种子Em基因(LEA 1)启动子的克隆与序列分析

根据已公布的大豆种子Em基因(LEA1)的5'末端序列设计二个基因特异反向引物(EmS1,EmS2).以大豆基因组DNA为模版,利用染色体步行(Chromosome Walking)法,获得了Em基因起始密码子上游836bp的特异DNA片段.进行序列测定和生物信息学分析.结果表明,这段DNA序列为一尚未在基因数据库登录的DNA片段.该序列含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,因此可能具有启动子活性.含有1个DRE1和2个ABRE,该启动子可能受到ABA和干旱等条件的诱导.含有1个AG-motif和1个ELRE-motif,该启动子可能参与创伤和诱导子等胁迫因素的应答.含有2个RY-repeat和1个TGTCACA-Motif,该启动子片段可能具有种子特异性.结果表明,所克隆到的片段可能为基因Em的诱导型启动子,并且很可能是种子特异性启动子.     

条锈菌诱导上调表达的小麦腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因的克隆及其特征分析

为了克隆条锈菌诱导上调表达的小麦腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因并研究其在小麦感病、抗病单株苗期抗条锈病防御反应中的作用,以大麦（Hordeum vulgareL.）SAMDC全长cDNA序列为信息探针,采用电子克隆、RACE（Rapid amplification of cDNA ends）和RT-PCR方法,从条锈菌（Puccinia stri-iformisf.sp.tritici）CYR32侵染的小麦（Triticum aestivumL.）抗条锈病新种质NR1121中分离出1个新的小麦SAMDC基因家族成员,命名为TaSAMDC2（GU016570）。TaSAMDC2基因cDNA序列全长2 003 bp,5′非翻译区区域和一个带有Poly（A）的3′非翻译区区域长分别为553和283 bp;该基因的开放阅读框为1 167 bp,编码388个氨基酸,编码的氨基酸序列包含酶原剪切位点和PEST结构域。基因组序列全长2 539bp,位于5′UTR存在一个526 bp长的内含子序列,内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则。同源序列分析表明,TaSAMDC2与来自大麦、水稻（Oryza sativaL.）、玉米（Zea maysL.）、一粒小麦（TriticummonococcumL.）4种植物SAMDC蛋白的相似性分别为95.0%、85.0%、80.0%和80.0%。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR分析表明,TaSAMDC2的表达受条锈菌诱导,小麦苗期经条锈菌侵染后,在抗病材料中,该基因于48 hpi上调表达至最高水平,而在感病材料中先下调、上调表达至最高水平明显滞后。结果提示,分离到的是一个条锈菌CYR32诱导后上调表达的小麦SAMDC基因,该基因可能参与了小麦的抗条锈病反应。     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

小麦细胞色素P450(TaP450)基因的克隆与序列分析

细胞色素P450是一种多功能氧化酶,在植物体内担当着生物合成、代谢解毒以及抗逆等重要功能。本研究采用RACE方法从普通小麦中同源克隆到一个新的P450基因,命名为TaP450(Genbank No.KJ541960)。该基因基因组序列全长为2 643bp,含有2个外显子和1个内含子,cDNA全长为2 033bp,含有一个1 557bp的开放读码框,推导蛋白含518个氨基酸;序列分析发现其具有保守的P450结构域,但该蛋白与已报道的小麦P450蛋白序列有较大差异,表明它是小麦P450家族的新成员;蛋白结构特征分析发现,该蛋白的分子量为57.092kD,等电点为8.63,N端具有一个含29个氨基酸的跨膜结构和一个含22个氨基酸的信号肽,亚细胞定位分析表明该蛋白属于分泌蛋白。其在小麦叶片、茎、根与种子中均有表达,但在叶片和茎中表达量最高;在胁迫处理下,该基因的表达量均上调,且在盐胁迫处理下上调尤为显著,表明该基因与盐胁迫密切相关。     

小麦TaDHN2基因及其启动子的克隆与功能研究

为给深入研究Ta DHN2基因在小麦抗旱机制中的作用机理奠定基础,并为进一步丰富小麦DHN基因研究内容提供参考,本研究通过筛选石麦15基因组BAC文库和BAC克隆测序方法克隆了Ta DHN2基因及其启动子,并对Ta DHN2基因序列特征、表达模式和启动子功能等进行了分析和探讨。结果表明,Ta DHN2基因含有1个88 bp的内含子,开放读码框长为696 bp,编码1个含有231个氨基酸的脱水素蛋白。Ta DHN2蛋白具有Y-segment、S-segment和K-segment结构域,属于YSK2类型脱水素蛋白。此外,该蛋白含有明显的核定位信号序列S-segment和基序RRKK。Ta DHN2基因受渗透胁迫诱导表达,在根和叶中表达模式类似,叶中表达量显著高于根中。Ta DHN2基因启动子序列长为2 025 bp,预测含有9个脱水响应顺式元件。在转基因拟南芥中,Ta DHN2基因启动子能够启动GUS基因表达,并在渗透胁迫下诱导GUS基因上调表达。以上结果说明,Ta DHN2基因为脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫强诱导启动子。     

巴西橡胶树胶乳亮氨酸氨肽酶基因克隆及表达

以巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis)无性系热研7-33-97的胶乳为材料,根据已报道的植物亮氨酸氨肽酶基因的保守序列设计简并引物,应用RACE技术克隆同源基因(HbLAP1).用生物信息学软件(DNA-MAN,DNAStar,ScanProsite,ClustalW)对HbLAP1进行生物信息学分析,通过Northern-blot分析HbLAP1的表达.结果表明,HbLAP1的cDNA全长1 985 bp,包括1个1 581 bp的阅读框,编码526个氨基酸的蛋白质,一个105 bp的5'非编码区和一个299bp的3'非编码区(括16个腺苷酸尾巴);HbLAP1是一种可溶性的细胞质氨肽酶结构域,割胶显著下调舶HbLAP1的表达.HbLAP1可能是乳管细胞茉莉酸信号途径的负调控因子.     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

小麦自主开花基因TaFLD单核苷酸多态性分析

为了给培育具有广泛生态适应性的小麦品种提供参考依据,通过比对拟南芥自主开花基因(FLD基因)与小麦D基因组序列,获得小麦FLD基因的同源序列.分析结果表明,小麦TaFLD基因全长8 392 bp,具有3 087 bp完整ORF,编码1 028个氨基酸,亚细胞定位预测显示,其编码蛋白定位于细胞质.TaFLD基因功能预测表...     

质子泵在不同氮素形态调控茶树磷素吸收的功能研究

磷是植物生长发育的重要矿质营养元素之一,不同氮素形态均影响植物对磷素的吸收。植物细胞膜H⁺-ATPase在矿质营养元素吸收过程中具有重要调控作用,因此不同氮素形态调控茶树磷素吸收可能与细胞膜H⁺-ATPase相关。本研究采用二相分离法提取茶树根系质膜,并通过非损伤微测（NMT）、Western-blot等技术探究不同氮素形态对舒茶早根系磷素吸收和细胞膜H⁺-ATPase特征参数的影响。结果表明,铵态氮提高茶树对磷素的吸收;其茶树根系细胞膜电位、H⁺跨膜运输、H⁺-ATPase活性和蛋白表达均高于硝态氮处理;且细胞膜H⁺-ATPase专一抑制剂正钒酸钠（Na₃VO₄）显著减少不同氮素形态下茶树根系对磷素的吸收和富集。由此可见,茶树根系H⁺-ATPase可能参与不同氮素形态调控磷素的吸收。     

In vitro and in silico analysis of two genes (A2-1 and G1-1) differentially regulated during dormancy and sprouting in potato tubers

Summary Two cDNAs, corresponding to genes differentially regulated during dormancy and sprouting in potato tubers, cultivar Désirée, were isolated: i) G1-1 corresponded to a gene that was turned off during dormancy and turned on during early phases of sprouting; ii) A2-1 corresponded to a gene activated during dormancy and strongly repressed during the transition from dormancy to sprouting. When induced, both genes were expressed at low level. Full-length cDNAs and genomic clones were isolated and characterized. G1-1 was a short gene, 452 bp long, containing an intronless open reading frame, coding for a putative protein of 64 aminoacids. Sequence analysis showed that G1-1 was homologous to an expressed sequence tag (EST) ofArabidopsis thaliana. A2-1 full-length cDNA was 1577 bp long and contained an open reading frame coding for a putative protein of 383 aminoacids, which contained a Walker box binding domain, common to a multifunctional family of intracellular ATPases.     

滨麦蔗糖:果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为了挖掘和利用滨麦(Leymus mollis,2n=4x=28,JJNN)的优良基因,以拓宽小麦非生物胁迫抗性基因资源,以滨麦为材料,利用RT-PCR结合RACE技术从滨麦叶片中克隆到6-SFT基因cDNA的全长序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,其cDNA全长为2 086bp,开放阅读框为1 866bp(命名为Lm-6-SFT),编码621个氨基酸;其推导的蛋白分子量为69.1kDa,理论等电点(pI)为5.18,属于酸性蛋白。保守结构域分析表明,该基因推导的氨基酸序列含有SDPDG、RDP和EC结构域。多序列比对及进化树分析表明,滨麦6-SFT与冰草6-SFT在氨基酸水平具有高度的序列相似性。