鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

马立克氏病病毒Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒(MDV)的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

马立克氏病病毒肿瘤Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒（MDV）的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

马立克氏病毒Meq基因的研究进展

随着致瘤基因Meq被发现，大量研究发现Meq基因在正常鸡细胞中没有表达，却在MD肿瘤中过度表达。Meq基因的表达不但可以转录活化某些致瘤相关基因，还可与转录辅助抑制因子结合成转录抑制复合物抑制目的基因转录，共同作用导致肿瘤发生。同时，Meq基因在不同毒株、不同血清型、不同病变组织中存在序列上的差异，他们是否存在着一定的规律也是研究人员十分重视的问题之一。本研究从Meq基因的基本特征入手，分析Meq基因与致瘤相关基因之间的关系分别进行阐述，总结相关的研究进展，为今后对肿瘤的深入研究提供参考。     

利用重组反转录病毒表达马立克氏病病毒Meq基因

为研究马立克氏病病毒Ｍｅｑ蛋白的生物学功能,应用磷酸钙与ＭＤＶ Ｍｅｑ基因重组的反转录病毒转染载体质粒ＲＣＡＳ－Ｍｅｑ的ＤＮＡ,转染于鸡胚成纤维细胞质ＤＦ１。经同间接免疫荧光技术研究表明,转染后第３天即开始有少量ＤＦ１细胞在细胞核表达Ｍｅｑ蛋白,以后阳性细胞增多,到转染后第７天阳性细菌最多,之后荧光即衰减,通过酶联免疫吸附试验检测,发现细胞培养上清中游离病毒在转染后第５天即可检出,直至第７天仍维持     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞表达马立克氏病病毒Meq基因

将源于马立克氏病病毒 ( MDV) GA株的 Meq基因克隆到杆状病毒转移载体质粒 p Blu Bac4中强有力的多角化蛋白启动子 ( PPH)之后 ,经与线性化的 Bac-N-Blue TMDNA共转染于昆虫细胞系 SF9,获得了重组杆状病毒。使用重组痘病毒表达的 Meq制备的单抗 ,对重组杆状病毒感染的 SF9细胞及其裂解物分别进行间接免疫荧光试验、Western blotting和免疫沉淀试验 ,结果发现 :( 1 )本表达系统产生的 Meq可被原制备的单抗所识别 ;( 2 )在感染细胞中 ,Meq蛋白仅局限于细胞核内 ,而且随着感染后时间的增加 ,具有从核质向核仁和核膜转移的趋向 ;( 3 ) Western blotting和免疫沉淀试验均证实重组杆状病毒感染细胞裂解物中出现有 2条特异带 ( 60 0 0 0处 )。结果表明 ,杆状病毒 /昆虫细胞系统用于表达外源蛋白是可行有效的     

3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病(MD)毒株目前的流行情况,在我国3个已免疫MD疫苗的白羽肉种鸡场暴发MD的鸡群中,通过临床剖检,组织病理学变化,病毒分离,IFA检测从发病鸡的淋巴细胞中分离到3株马立克氏病毒(MDV),并分别命名为SDAU1501、SDAU1502和SDAU1503。采用PCR方法扩增3株MDV的vIL8、pp38、meq致病基因,所得氨基酸序列与已发表的参考毒株序列进行比较分析,结果显示SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株的同源性达到97%以上,具有强毒特征;而SDAU1503的meq基因在第194位具有与CVI988同样的缺失(P),但其没有CVI988中177个核苷酸的插入突变,其具有与弱毒疫苗株的特征。MDV新的变异在不断发生,出现了不同类型的变异株,因此,对MD的流行情况与基因监测应当继续下去;同时,在MDV疫苗的研制更新上还有待于进一步研究。     

超强马立克氏病病毒的鉴定及病毒Meq基因序列的比较

对1例感染超强马立克氏病病毒的病例进行确诊,对感染病毒的Meq基因进行比较分析。采用病理解剖、PCR检测、病毒分离、动物试验和Meq基因序列分析,对感染病毒进行研究。病理解剖结果为病死鸡的肝脏、脾脏、腺胃、肌胃、十二指肠表现为肿瘤病变。PCR检测结果为病死鸡的组织病料感染马立克氏病病毒。病毒分离和动物试验结果证明该感染病毒是1株马立克氏病超强毒株,该病毒可以引起免疫过CVI988疫苗的鸡发病。Meq基因序列分析表明该病毒与7株马立克氏病病毒参考毒株的同源性为98.8%~99.6%,该病毒在Meq的第115、119和176位氨基酸突变同国内流行株,该检测病毒在Meq的第217位氨基酸突变同超超强马立克氏病毒株。结果表明,通过病理解剖、PCR检测、基因序列分析、病毒分离和动物试验,确诊病鸡感染超强马立克氏病病毒。     

马立克病病毒致瘤蛋白Meq转录调节鸡p21基因的表达

为研究马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)致瘤蛋白Meq对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21表达的调节作用,采用RTPCR、Western blot方法检测Meq蛋白表达在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)中对p21 mRNA和蛋白水平的影响。然后,构建p21启动子的荧光素酶报告载体,检测Meq蛋白对p21的启动子活性的影响。最后,分别用MDV Md5强毒株和CVI988/Rispens疫苗毒株感染CEF细胞,利用Western blot检测MDV感染后p21蛋白水平的变化。结果:过表达Meq上调p21的mRNA和蛋白表达水平,Meq能够激活p21基因启动子活性,MDV感染细胞中p21蛋白的表达水平也有明显升高。这些发现为了解Meq在MDV感染中的作用机理奠定了基础。     

超强马立克病病毒株的致病性研究

拟对一株超强马立克病病毒(MDV)SD2012-1株的致病性进行研究。将60只SPF鸡平均分成未免组、HVT免疫组和CVI988疫苗免疫组3组。于1日龄时对其进行马立克病(MD)疫苗免疫,于10日龄时进行SD2012-1攻毒;每天观察攻毒鸡临床症状,对病死鸡进行病理剖检和组织学观察;用PCR反应对感染鸡进行MDV跟踪监测。病理学研究结果显示:攻毒后第2周,试验鸡有轻微组织病变;攻毒后第6周,试验鸡有眼观病变,镜检有散在的肿瘤细胞团块;攻毒后第9周,试验鸡有明显的眼观肿瘤病变,镜检有大量肿瘤细胞聚集;SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫,引起高达30%的鸡发病。PCR跟踪监测结果显示:攻毒后第5天,未免组和HVT免疫组可检出MDV;攻毒后第10天,未免组和HVT免疫组阳性检出率均为100%,CVI988免疫组阳性检出率为30%;攻毒后第20天,3组试验鸡阳性检出率均为100%;用PCR检测病死鸡的肝、肾、肌胃、肠系膜、十二指肠、心和法氏囊样品的结果均为MDV阳性;攻毒300d后,健康存活鸡的羽髓PCR检测结果均为MDV阳性。结果表明,HVT疫苗对于SD2012-1株几乎无保护作用,超强马立克病病毒SD2012-1株能够长期在免疫鸡体内存在,突破免疫保护,引起发病,这对国内防控鸡马立克病提出了严峻挑战。     

鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析

从感染鸡马立克病病毒血清Ⅰ型(MDVⅠ)814株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总DNA,以其为模板,根据GenBank中MDVⅠ GA株基因组gE、gI、gp82基因序列,设计并合成3对特异性引物,用PCR方法分别扩增了814株的gE、gI、gp82基因,并将扩增的基因片段克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,应用DNA Star软件分析814株gE、gI、gp82基因核苷酸序列,并与已发表的MDVⅠ毒株序列进行了比较.结果表明,不同MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因同源性很高,814株与已发表的MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因核苷酸序列同源性分别在99.4%、98.9%和99.6%以上.     

我区鸡马立克氏病病毒株的分离

我区鸡马立克氏病病毒株的分离姜智杰孙吉成王新建宁岐山丁日华（塔河县畜牧局·１６５２００）近年来，我区鸡群接种ＨＶＴ疫苗后ＭＤ发病率仍然较高，一般达３％～１５％，甚至高达５０％以上。我们从病鸡分离到ＭＤ强毒，对分离到的强毒进行了有关生物学实验，为有效地...     

马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1~10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9-1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。     

马立克氏病病毒“814”疫苗株基因组重复区序列测定及分析

为了解马立克氏病病毒(MDV)强、弱毒株主要致肿瘤相关基因变异情况,本研究根据MDV GA株基因组序列,设计合成扩增基因组重复区的引物,得到MDV814疫苗株病毒基因组中约26kb的序列片段。与GenBank登录的强、弱毒株进行比较分析表明,扩增的MDV1型814疫苗株的长重复区为12774bp,预测的开放阅读框(ORF)有48个;短重复区为11426bp,预测的ORF有38个。发现了4个MDV814株特有的ORF。814株在编码Meq、RLORF6和23ku的重叠基因内具有类似于疫苗株CVI988的177bp的插入;在RLORF12基因编码区内存在69bp的缺失,该缺失位于病毒复制起始位点内。同时,发现7个814疫苗株特有的氨基酸突变,分布在6个ORF内。单核苷酸多态性(SNP)的鉴定发现,多个基因具有单核苷酸的突变,主要分布于Meq基因,其中氨基酸A115V(丙氨酸-缬氨酸),N142D(天冬酰胺-天门冬氨酸)的变异是814疫苗株所特有的。MDV814疫苗株重复区的基因序列的比较分析将有助于MDV致肿瘤机制的研究。     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。     

马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的克隆和序列分析

参考GeneBank发表的马立克氏病病毒(MDV)国际标准强毒株GA的基因序列，设计合成一对引物，分别以RBIB，814，GD2(广东分离株)，J-1-E(北京分离株)，Md11，Md5，CV1988等不同毒株的MDV基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得了预期大小的PCR产物。该产物经pGEM-T-easy克隆后测序，将所得序列进行比较分析。结果发现：不同毒株间pp38基因的启动子和增强子序列间有缺失突变，序列的同源性大于95．9％，其中大多数的突变发生在MDV复制的原点附近。     

马立克病病毒致瘤相关基因的研究进展

从meq基因、pp38复合体、HSV ICP4的同源体、L开放阅读框（L ORF）、位于BamHI—H片段的基因和病毒类白细胞介素-8（vIL-8）等几个方面论述了马立克病病毒感染期间参与肿瘤形成的相关基因的生物学活性。