透明颤菌血红蛋白基因对苏氨酸发酵生产的影响

将透明颤菌血红蛋白（VHb）基因转化至苏氨酸发酵基因工程株E.coli中,研究了导入VHb基因对苏氨酸发酵生产的影响。结果表明,改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加。以不同碳源发酵时,摇床培养提高苏氨酸产量28.7%～55.4%,以不同氮源发酵时提高产酸7.4%～36.1%。导入VHb基因对菌体生长动力学的影响较小,但对苏氨酸产酸动力学曲线作用较显著。基因改造提高了菌株的生长与苏氨酸合成能力,并能缓解摇床转速较低时供氧对发酵的限制。     

透明颤菌血红蛋白(VHb)基因合成及原核生物中的效应

以“连续延伸ＰＣＲ基因合成法”（姚泉洪１９９９），按植物偏爱密码子，合成了全长４４１ｂｐ的透明颤菌血红蛋白（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＶＨｂ）基因。此方法不需用连接酶，而用高保真ＤＮＡ聚合酶ｐｗｏ及７个长度为９０ｂｐ左右的长寡核酸引物，经一次ＰＣＲ反应即完成了全长为４４１ｂｐ基因合成。ＰＣＲ产物经ＢａｎＨＩ和ＳａｃＩ酶切，克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体，合成的ＶＨｂ基因经克隆和测序证实与设计一致。与报道的ＶＨｂ基因相比，核苷酸改动了９８个。Ｇ＋Ｃ含量由原来的４５．３％提高到４７．８％。将该基因克隆入庆大霉素抗性基因启动子后，构建表达载体ｐＹＰ２００１ｈ（ＶＨｂｐ）。将其转入大肠杆菌菌株ＤＨ５α，在氧胁迫、缺乏、充足等三种情况下，绘制其生长曲线，探讨了合成ＶＨｂ基因在原核生物中的效应。结果     

透明颤菌血红蛋白基因vgb的表达对杨树氮素利用能力的影响

以转透明颤菌血红蛋白基因（vgb）京2杨为材料,采用qRT-PCR分析方法确认其外源基因在转基因无性系中可以正常表达。盆栽试验结果显示,在正常生长条件下转基因无性系的株高和地径显著提高,同时叶片全氮质量分数上升。进而利用非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technique, NMT）对植株根部NO₃^-吸收情况的检测发现,在含有0.5 mmol/L NO₃^- 测试液中转基因无性系NO₃^-吸收速率大于非转基因植株。此外,研究还发现,转基因无性系的硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性显著提高。可见：vgb的表达能提高杨树的氮素利用能力。     

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感,为了改善这一溶氧问题,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pU8600上,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒pHZ1276。pHZ1276通过接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),所得重组子经Southern杂交验证后,进行诱导表达,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

透明颤菌血红蛋白的生理功能机制与应用

透明颤菌在贫氧条件下能大量合成一种同源双亚基血红蛋白.在异源宿主中表达该蛋白常常可以促进微生物生长,提高降解有毒代谢物的能力,促进氧的存贮和氧的传递, 增加氧的流量.最新研究显示,透明颤菌血红蛋白将氧直接传送给完整的细胞色素bo末端氧化酶亚基Ⅰ,并在亚基Ⅰ的双核心处将氧还原成水,表明该血红蛋白只有与细胞色素bo相互结合时才能发挥其重要的生理功能.     

透明颤菌血红蛋白基因在多粘芽孢杆菌中的克隆和表达

本研究将启动子P43与透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)基因(vgb)通过重叠PCR进行融合,克隆到芽孢杆菌表达载体p CM20上,将筛选得到的重组载体p CM20-vgb转化多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NR1,Western-Blot表明重组菌株表达了VHb蛋白,该蛋白的表达对重组菌体的生长和多粘菌素的产生均有促进作用。     

透明颤菌血红蛋白基因的植物化改造合成及其在大肠杆菌中功能的鉴定

 根据透明颤菌血红蛋白（VHb）的氨基酸序列，按照植物偏爱密码子，对透明颤菌血红蛋白基因（vgb）进行优化改造，同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点，设计并合成了22条单链DNA短片段，通过拼接获得了全长450 bp的透明颤菌血红蛋白基因vgbM，并将其克隆至pUC19上，获得重组质粒pGSVHB。利用设计的引物，通过PCR在vgbM基因的5′端引入NcoⅠ位点，将其克隆到原核生物高效表达载体pBV221上，获得质粒pBV221SVHB。转化E.coli. BL21并经热激诱导表达后，在培养物中检测到了约16 kD的VHb蛋白。经CO差示光谱分析测定，该蛋白具有生物活性。为透明颤菌血红蛋白基因vgbM在植物基因工程研究中的应用奠定了基础。     

利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。     

透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达.转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

透明颤菌vgb基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

【目的】将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgb)在枯草芽孢杆菌中进行整合表达,提高β-半乳糖苷酶的产量。【方法】用枯草芽孢杆菌整合载体pA01和启动子P43构建vgb基因的整合表达载体pA-vgb,通过双交叉整合方式,将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌DB104:bga的染色体上,构建枯草芽孢杆菌DB104:vbga。采用PCR和Southern blot对DB104:vbga进行检测,并通过发酵摇瓶试验研究VHb对β-半乳糖苷酶产量的作用。【结果】PCR与Southern blot检测结果表明,枯草芽孢杆菌DB104:vbga中vgb基因整合位置正确,且表达的VHb蛋白具有生物学活性。摇瓶试验结果表明,在转速250 r/min条件下,枯草芽孢杆菌DB104:vbga与DB104:bga的β-半乳糖苷酶活性无显著差异;在150 r/min的限氧条件下,vgb基因的表达促使DB104:vbga的β-半乳糖苷酶活性较DB104:bga提高了14.9%。【结论】vgb基因可用于提高枯草芽孢杆菌目的蛋白的产量。     

透明颤菌血红蛋白基因在吸水链霉菌NND-52-C中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)克隆至链霉菌的质粒载体pIJ702中，构建成表达载体pLY702，并将pLY702质粒转化阿扎霉素B的高产菌株——吸水链霉菌NND—52—C的原生质体，获得转化子H。经发酵实验表明，在限氧的条件下，可以使NND—52—C菌株的生物量提高14．4％，阿扎霉素B的产量提高30．8％。     

兰州大尾羊血红蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶水平板电泳检测了１３只兰州大尾羊的血红蛋白（Ｈｂ），结果表明，Ｈｂ位点存在 ＨｂＡ和 ＨｂＢ两个等位基因，频率分别为 ０．７９３９、０．２０６１，其中 ＨｂＡ为优势基因。存在ＨｂＡＡ、ＨｂＡＢ和ＨｂＢＢ３种基因型，频率分别为０．０５３４、０．３０５３和０．６４１３，其中ＨｂＢＢ为优势基因型。对６６只兰州大尾羊血红蛋白基因型与红细胞压积（ＰＣＶ）的相关分析表明：ＨｂＡＢ型的ＰＣＶ大于ＨｂＢＢ型，但差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

Anti-trxs和Bar基因共转化小麦后代植株的遗传及表型分析

经对基因枪转化小麦品种皖麦48获得的7株再生苗的PCR、PCR-Southern杂交和除草剂涂抹叶片检测,得到了4株转基因植株,证实了硫氧还蛋白反义基因(Anti-trxs)和抗除草剂Bar基因已经整合到小麦基因组中且能够正常表达。经对T1、T2植株分析表明:Anti-trxs、Bar基因能够稳定的遗传给后代,且普遍呈3∶1的分离,其遗传符合单基因控制的孟德尔遗传规律,部分株系表现1∶1的不正常分离(阳性个体较预期的少),推测这是由于雌或雄配子之一方丢失或外源基因的结构、排列等方面发生了变化的结果。转基因植株的农艺性状与对照相比,T0代有较大变异,但在T2代已得到了回复。     

弗兰克氏菌转化研究初报

完成了弗兰克氏菌菌株C101,Cc01,CcR03,At4,Hr16和CG01的原生质体分离及Cc01原生质体的再生。将菌丝转化技术用于弗兰克氏菌的转化研究,结果发现,pLAFRI上的四环素抗性基因能在Cc01中表达。此外,Cc01具有卡那霉素抗性。     

转PSAG12-IPT基因小麦安全性的初步研究

对转PSAG12 IPT基因小麦植株根际土壤及其周边小麦、大麦、燕麦进行了基因漂移检测,并对食用转PSAG12 IPT基因小麦混合饲料的小白鼠进行了毒理性试验,初步研究了转PSAG12 IPT基因小麦的安全性。结果表明,PSAG12 IPT基因并未通过根系分泌物漂移到土壤中;除西农1376在距离T2代西农1376小麦3和6m处各发现1株PCR阳性植株外,在小麦郑9023及大麦和燕麦中均未发现PSAG12 IPT基因存在;食用含有转基因小麦混合饲料的小白鼠和对照小白鼠的肝脏和肾脏的结构解剖图未见明显差异,可以初步认为应用转PSAG12 IPT基因小麦是较安全的。     

溶氧控制对氨基酸发酵的影响

对溶氧控制对氨基酸发酵工艺的影响及增加溶氧的一些方法进行了综合分析与探讨。     

紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因抗性苗耐盐性研究

在紫花苜蓿抗旱、耐盐碱转基因抗性苗和对照苗的组织培养过程中模拟盐胁迫生境,经0%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%、1.9%NaCl处理15 d后,苜蓿转化苗和苜蓿对照苗的盐适应性生长性能发生变化.观察统计了转基因抗性苗和无菌苗在盐胁迫下的成活率;测定了这2组苜蓿植株的根长和叶片的电导率.结果表明:转化苗比对照苗耐受盐胁迫的能力要高,转化苗能够耐受1.3%的NaCl盐浓度,在NaCl浓度为1.5%时其生长才开始受到损伤,而对照苗只能在NaCl浓度0.5%以下正常生长,在NaCl浓度为0.7%时其生长即开始受到伤害.同时,在盐胁迫下,转化苗的根生长能力要强于对照苗.在同一盐浓度下转化苗的细胞膜透性比对照苗的细胞膜透性要低,表明苜蓿转基因抗性苗比对照苗耐受盐伤害的能力强.