猪乙型脑炎PrM-E重组腺病毒的构建及免疫原性

应用RT-PCR方法扩增出猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因,经序列测定正确后,通过SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点把该基因插入经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中,获得重组穿梭质粒pDC315-PrM-E。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所插入的基因是正确的。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1.3Cre共转化293细胞获得重组腺病毒Ad-PrM-E。经PCR鉴定证明所构建的重组腺病毒含有PrME基因。小白鼠免疫28 d后进行间接ELISA检测证明所构建的重组腺病毒在小白鼠体内能够诱导产生抗JEV的抗体,阳转率90%。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

多角体包裹型猪α干扰素在昆虫细胞中的表达

为了获得多角体包裹的重组猪α干扰素,应用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统,将多角体蛋白基因和编码成熟猪α干扰素的基因分别构建到p Fast Bac Dual载体的PH、P10启动子下,以多角体蛋白H1α-螺旋序列为信号肽。将构建质粒转化DH10BacTM感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒。通过间接免疫荧光、Western-Blot证明,多角体蛋白与猪α干扰素实现共表达,在信号肽引导下猪α干扰素被包埋进多角体;用微量细胞病变抑制法检测显示,多角体包裹的猪α干扰素有抗病毒活性,效价达到5亿U/mg以上。应用在昆虫细胞中表达的多角体包裹型猪α干扰素,在临床上为猪病毒性疾病的防治与治疗奠定了基础。     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。