卷首语

<正>本期以下4篇论文值得关注:国家油菜改良中心付三雄博士采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一种油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶基因。试验通过设计引物克隆了丙酮酸激酶基因的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Notl和Xhol酶切,酶切产物连接到新近改造的RNAi平台载体的Notl和Xhol位点,利用多重PCR技术证实载体构建成功,然后将丙酮酸激酶基因反向重复框克隆到加入启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的丙酮酸激酶基因的RNAi载体。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰（RNAi）载体,通过设计引物克隆了 PK基因长498 bp的 siRNA靶序列,连接到 pEASY-T1载体上,采用 NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的 RNAi 平台载体 pHurricane 的 NotI 和XhoI位点,通过多重 PCR 鉴定证实载体构建成功,然后将上述 PK基因反向重复框克隆到加入 napin启动子的 pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究 PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建(英文)

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的RNAi平台载体pHurricane的NotI和XhoI位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

莱茵衣藻MAPK4基因RNAi载体的构建及鉴定

[目的]构建莱茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi载体。[方法]提取莱茵衣藻细胞总RNA,利用PCR扩增出编码MAPK4的基因片段,用基因工程技术将MAPK4基因片段连接载体p MD18-T上,经过2次不同的双酶切后,与RNAi中间载体p T282连接,最后连接到干涉载体p Maa7IR/XIR上,用酶切及测序鉴定MAPK4基因RNAi载体并转化莱茵衣藻。[结果]经限制性内切酶酶切及测序鉴定,证实为重组质粒,并且该重组载体可在莱茵衣藻中表达。[结论]构建的MAPK4基因RNAi载体结构正确,为进一步利用RNAi技术使MAPK4基因沉默表达,研究MAPK4在莱茵衣藻中的生物学功能奠定了试验基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

 【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

无花果ACS1基因RNAi植物表达载体构建

通过构建无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体,为研究ACS基因的功能及采用生物技术方法培育无花果耐贮新品种奠定基础。本试验根据已克隆的无花果ACS1基因序列及植物表达载体pBI221、pBI121的酶切位点,设计2对带相应酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,进行PCR扩增,获得正、反向扩增片段,分别正、反向插入到pBI221载体中的CaMV35S启动子和gusA基因之间,构建成无花果ACS1基因的RNAi中间表达载体。再将中间载体中的正、反向片段和gusA基因以双酶切方式连接到表达载体pBI121上,构建成pBI121-RNAi-ACS1植物表达载体。通过各种限制性内切酶的酶切鉴定,成功构建了无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体。     

蓝莓苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达载体构建

为进一步探讨苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达和研究其功能,采用通用植物总RNA提取试剂盒提取蓝莓果实总RNA,并根据同源基因设计相关引物,利用反转录PCR方法克隆苯丙氨酸解氨酶PAL编码基因,将其连接到pMD18-T载体上构建克隆载体并酶切鉴定。然后将PAL目的基因连接到pET-20b(+)上构建表达载体,并通过PCR检测和酶切双重方法鉴定。结果表明,成功获得了258bp大小的PAL片段,并成功构建表达载体。     

Metallothionein克隆载体及表达载体的构建及转化矮牵牛的初步研究

Metallothionein基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pc2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建含有目的基因的表达载体,进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。     

芸薹属查尔酮合酶基因家族RNA干扰载体的构建

采用PCR法克隆芸薹属CHS基因家族的RNAi片段,经T-载体克隆并测序后,用特定的双酶切方案将其反义片段、正义片段分别亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌,完成复合PCR鉴定,然后转化根癌农杆菌。结果表明:经测序,以甘蓝型油菜BnCHS1基因为模板克隆的芸薹属CHS基因家族的RNAi片段BCHSI为831 bp,采用Nco+Aat和BamH+Xba分别将其反义和正义片段亚克隆到pFGC5941M中;经复合PCR鉴定,11 814 bp的RNAi载体pFGC 5941M-BCHSI(简称pBCHSI)构建成功,并获得了根癌农杆菌LBA4404的工程菌株。芸薹属CHS基因家族RNAi载体的成功构建,将促进甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种类黄酮性状的研究与修饰。     

抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体构建

本研究采用RT-PCR克隆大豆子粒Le1基因核心保守序列515bp片段,以植物表达载体pCAMBIA1301为基本载体,构建了抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体。通过酶切检测及测序,证明表达载体构建正确。本研究为通过RNAi技术降低大豆中凝集素含量,改良大豆品质奠定了基础。     

玉米sbe2a基因RNAi载体的构建及转化玉米的初步研究

采用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列分析.结果表明:克隆片段长度为562bp,将该基因的正义和反义片段插入到pCAMBIA1301改造过的载体p35-1301的35S启动子下游,构建高效RNAi表达载体,通过花...     

甘蓝型油菜脂肪酸延长酶FAE1 RNA干扰体的构建

利用来源于油菜fael基因编码区的长498bp的2个片段，反向连接于1个83bp的内含子两端，构建成RNAi载体，以期在油菜中转录后能有效抑制fael基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长2066bp，经限制性内切酶消化及序列测定验证，其序列结构与设计一致。通过农杆菌介导的油菜转化，获得油菜再生株系29个。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

甘蓝型油菜酯酶基因BnLIP2的克隆及其植物超表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜BnLIP2基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 170bp.将甘蓝型油菜BnLIP2基因定向克隆到植物表达载体pCambial300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

白菜型油菜BrDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了白菜型油菜BrDAD1基因及自身的启动子基因Pro-DAD1,并将其分别克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因及启动子全序列。结果表明,该基因及启动子全长分别为1 270 bp与1 335 bp。将白菜型油菜BrDAD1基因反向克隆到植物表达载体pCambia 1300的自身启动子基因Pro-DAD1启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体pCamDAD1。     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

甘蓝型油菜pep基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义、利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序．测序结果表明：扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95％．用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBII21．N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到湘油15号中。     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

百合GBSS基因RNAi载体构建

为研究GBSS基因在百合鳞茎形成及发育过程中影响鳞茎淀粉合成代谢的作用机理,构建干扰GBSS基因的RNAi载体为其在转录水平沉默表达提供材料。从百合鳞片克隆GBSS基因300 bp的保守序列,通过BP与LR反应将该序列正反向连接到干扰载体pJawohl8-RNAi中,经过酶切反应鉴定所构建RNAi表达载体的正确性。实验成功构建pDONR221-GBSS入门克隆与pJawohl8-RNAi-GBSS表达载体,为在百合鳞茎淀粉合成代谢途径中研究GBSS基因功能及对鳞茎发育的影响提供了材料与思路。