猪伪狂犬病实验室诊断技术研究进展

伪狂犬病(Pseuolorabies),亦称奥叶兹基氏病,是由疱疹病毒科的甲型疱疹病毒引起的一种急性传染病。可感染多种动物,猪是本病的主要宿主和带毒者。以妊娠母猪的繁殖障碍综合症(流产、死胎、木乃伊和不育症等)、幼龄仔猪死亡率高、育成猪群免疫力遭受破坏而造成呼吸道感染等急剧增多、以及康复猪终生带毒、疫病反复发作难以扑灭净化为主要特征。是世界上许多国家养猪业受     

猪伪狂犬病诊断报告

<正> 猪伪狂犬病是由猪疱疹病毒Ⅰ型引起的传染病。对猪群危害大,成年猪为隐性感染,可有流产、死胎及呼吸症状;仔猪感染后症状急剧,死亡率高。猪以外动物呈现奇痒和神经症状而死亡。我们于1993年5月在我省赣东某县一猪场发现本病,现报道如下。     

猪伪狂犬病的诊断

通过对发生在浙江省宁波市某猪场的一起猪伪狂犬病的诊治,从猪伪狂犬病的诊断技术,预防措施对猪伪狂犬病进行了较全面的介绍,以期为猪伪狂犬病的预防和治疗提供参考.     

猪伪狂犬病的诊断报告

1974年以来,克东县多次发生猪伪狂犬病,给养猪业造成很大损失。为引起人们的重视,现将猪伪狂犬病诊断情况报告如下。 1 发生情况及临床症状 1974年以前克东县末发生猪伪狂犬病。这年8月克东县种猪场仔猪发生一种以神经症状为主,成窝发病,大批死亡的疫病。该场可繁母猪,十天     

一起猪伪狂犬病的诊断

盱眙县河桥镇一新建猪场有10头母猪,2 0 0 2年2月相继有3头母猪发生流产和死胎。有窝初生仔猪在3 2 0日龄突然发病,以体温升高、运动不协调、转圈、呕吐、腹泻、迅速衰竭死亡为特征。曾用过多种抗生素及病毒唑等治疗无效,病程约3 5d ,死亡率高达10 0 %。2月2 7日到我站就诊,根据临床症状、病理变化、初步诊断为猪伪狂犬病。进一步进行了实验室检查,用病料对家兔肩胛部接种后,接种部位发生剧痒,试验兔抓咬患部。同时将血清送至有关单位作中和试验,证实为阳性,而细菌学检查则为阴性。由此确诊为猪伪狂犬病。遂对所有猪进行伪狂犬病疫苗接种。1…     

猪伪狂犬病的诊断报告

１发病情况及临诊症状近二年来,我市不少猪场都反映哺乳仔猪存活率很低,特别是３～５日龄的仔猪常常突然发病,死亡率很高,常整窝整窝的死亡。多数病猪表现呕吐、腹泻、体温升高、不哺乳以及不同程度的神经症状,如转圈运动,间歇性抽搐,昏迷,站立不稳,倒地,两脚划...     

一例猪伪狂犬病病毒的诊断

2015年11月,当地某养殖户15日龄仔猪出现角弓反张、精神沉郁等疑似猪伪狂犬病病毒感染的典型神经症状,但查看免疫程序,已免疫猪伪狂犬病疫苗（Bartha-k61株）。经gE基因血清学调查和针对gE基因的PCR诊断,证实该病例为猪伪狂犬病病毒感染所致。     

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒（PRV）gH基N与猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRVgH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEMTEasy载体,转化大肠杆菌DH5a,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRv荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80．8℃和86．7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝／μL和180拷贝μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

闽北地区猪伪狂犬病抗体检测分析

为了解猪伪狂犬病在闽北地区的流行情况,整理并分析2015年度血清抗体检测数据。采用ELISA检测方法对闽北地区45个规模化猪场进行检测分析,通过检测样品血清中伪狂犬病gE抗体和gB抗体的水平进行结果判定。结果显示：送检的45个规模化猪场,伪狂犬病gE抗体阳性场达25个,猪场阳性率达55.6%;共检测1304份血清,其中伪狂犬病gE抗体阳性213份、可疑24份、阴性1067份,抗体阳性率达20.6%。从伪狂犬病gE抗体阴性猪场抽检猪伪狂犬gB抗体380份,gB抗体阳性258份,猪群伪狂犬病抗体保护率仅有67.9%。     

种公猪精液伪狂犬病野毒的筛查

本文基于1 100头基础母猪的规模化场进行公猪精液伪狂犬病病毒筛查,农业部规定伪狂犬病病原学检测方法是通过ELSIA方法检测猪伪狂犬病gE野毒抗体。由于抗体检测具有滞后性,导致正在发生感染的猪群g E抗体检测往往呈阴性,但此时通过病原学检测精液已经正在排毒。本文互补了ELSIA抗体检测方法与荧光定性PCR检测病原的优劣,成功实现种公猪精液伪狂犬病病毒的筛查。     

PCR法对伪狂犬病病猪不同部位的检测及敏感性试验

应用ＰＣＲ方法对ＰＲＶ感染细胞及自然发病猪不同组织样品进行检测,感染细胞毒最低检出量为１０５个ＴＣＩＤ５０病料组织样品最低取样为０１ｍｇ时,仍能得到阳性结果其敏感性显著高于微量血清中和试验。ＰＲＶ在自然发病猪体内分布很广,脑、三叉神经节（三叉Ｎ节）、嗅球、扁桃体、心脏、肝、脾、肺、肾均有ＰＲＶ的存在,ＰＲＶ检出率最高的组织为三叉神经节,其检出率为１００％。其它对照病毒及传代细胞ＰＣＲ反应产物电泳结果均为阴性。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。