条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

小麦根腐离蠕孢菌诱导小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其表达

为了明确小麦受小麦根腐离蠕孢侵染后β-1,3-葡聚糖酶基因的表达情况,采用RT-PCR方法在受小麦根腐离蠕孢菌侵染后的小麦叶片中扩增β-1,3-葡聚糖酶基因,然后对侵染后的小麦叶片总RNA进行Northern斑点杂交。结果表明,克隆到了β-1,3-葡聚糖酶基因,该基因在小麦被侵染12 h时开始表达,在48 h后未见表达。对照中未见表达。可推断出此β-1,3-葡聚糖酶基因是被小麦根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokinianum）侵染后诱导表达的。     

指天蕉β-1，3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

 【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1, 3-葡聚糖酶基因,为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因,据其保守区域设计一对简并引物,通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp,其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中,与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高（71%）。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物转基因抗病育种研究奠定了基础。     

小麦β-1,3-葡聚糖酶性质及其对小麦根腐离蠕孢菌的抑菌作用

为了明确小麦根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokinianum）侵染小麦后被诱导表达的β-1,3-葡聚糖酶基因所编码的β-1,3-葡聚糖酶的性质及其与抗病性的关系,采用生物信息学的方法对β-1,3-葡聚糖酶的一级结构、信号肽和跨膜结构进行了预测分析。结果表明β-1,3-葡聚糖酶是一种分泌型碱性蛋白酶,主要存在于胞外。将克隆到的β-1,3-葡聚糖酶基因构建成重组质粒并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,分离纯化得到了原核表达的β-1,3-葡聚糖酶,对其在体外对小麦根腐离蠕孢菌生长的抑制作用的研究发现,β-1,3-葡聚糖酶对小麦根腐离蠕孢具较强抑菌活性。     

不同抗性小麦品种受叶锈菌侵染前后防卫酶活性变化研究

对小麦叶锈菌侵染前后2个不同抗性小麦品种叶片中的POD、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶4种防卫酶的活性变化进行了研究。结果表明:在接种前,抗病品种的POD和PPO活性均高于感病品种,而抗、感品种间PAL和β-1,3-葡聚糖酶的活性差异不大;接种叶锈菌后抗病品种和感病品种小麦叶片中的4种防御酶活性均高于未接种处理,并且抗病品种接种后PPO活性变化幅度明显高于感病品种;抗病、感病的小麦接种叶锈菌处理与未接种处理的POD、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶4种防卫酶的活性均升高,POD、PPO、PAL 3种酶活性在接种后3 d达到峰值,β-1,3-葡聚糖酶在接种后4 d达到峰值;相对于其他防御酶,PAL在测定期内活性变化程度不高,表现平稳。     

葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析及表达

为验证葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄抗病防御机制中的作用,本研究以金星无核葡萄叶片为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到1个长度为1 244 bp的葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因。采用生物信息学方法对其开放读码框和理化性质进行分析,结果显示,该基因包含1个长度为1 083 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白质含360个氨基酸,分子量为89 440,理论等电点为4.83。系统进化分析结果显示,β-1,3-葡聚糖酶基因所编码的氨基酸序列与桃、豌豆和水稻的同源性分别为62.1%、60.8%和33.1%。定量PCR分析结果显示,在霜霉病菌侵染后的72 h内均可诱导该基因的表达,且表达量均高于对照,表明β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄应答霜霉病菌侵染过程中可能发挥一定作用。     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆及序列分析

β-葡聚糖是以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接形成的D-葡萄糖聚合物,主要存在于单子叶禾本科谷实中.有些微生物会产生降解β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶.将β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中表达对动物饲料工业具有十分重要的应用价值.实验以地衣芽孢杆菌为材料,提取其总DNA,扩增其β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序列,将该片段克隆到pMD 19-T载体进行测序,并将测序结果进行BLAST比对.发现其与GenBank中的两段基因序列具有较高的同源性.     

小麦新种质P13的抗条锈性鉴定及抗病机制研究

【目的】探索小麦新种质P13对条锈病的抗病性及其抗性机制,为P13种质的进一步推广利用提供理论依据。【方法】以铭贤169为感病对照,用6个条锈菌生理小种(CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和Hybrid46-8)对P13进行苗期抗条锈性鉴定;采用自然诱发法鉴定P13的田间抗条锈性;以P13和铭贤169为材料,采用常规的夏孢子悬浮液涂抹法接种条锈菌CYR29,以不接种为对照,然后测定多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等抗病相关酶活性。【结果】苗期P13对CYR32表现为免疫,对CYR29、CYR33和Hybrid46-8表现为近免疫,对CYR23表现为高抗,对CYR31表现为感病。P13在拔节期、孕穗期和乳熟期均表现为免疫或近免疫。 P13接种条锈病菌CYR29后,其叶片内POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性均高于未接种植株和感病对照铭贤169。【结论】P13对贵州小麦条锈菌生理小种表现出较强的抗病性,其在贵州小麦生产及抗病育种方面具有极高的应用价值。     

多粘类芽孢杆菌CP7β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及应用

【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,经体外消化后黏度降低了4.69%(P﹥0.05)。【结论】β-1,3-1,4-葡聚糖酶是CP7菌发酵液中抗真菌活性组分或其中之一,对真菌生长抑制的活性作用提示其可作为农业抗病虫害新型药物进行开发研究;该酶能够有效降低麦类饲料黏度,表明其作为饲料添加剂的开发利用同样具有良好前景。     

小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作cDNA文库的EST分析

 【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。     

小麦条锈菌转录因子PsSte12的克隆及生物学分析

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

多粘芽孢杆菌β-葡聚糖酶特性及其基因克隆

对多粘芽孢杆菌所产的β-葡聚糖酶特性进行了分析.结果表明:该酶的最适温度为50 ℃,在60℃以下酶相对稳定.通过PCR方法扩增和克隆了该酶基因的全长DNA序列,长度为734 bp,其中开放阅读框架长714 bp,编码238个氨基酸.经Blast分析,该序列与已登陆的多粘芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌的同源性较高,分别为99%和82%.     

小麦过敏性诱导反应基因TaHIR4的克隆及序列分析

【目的】克隆条锈菌诱导的小麦过敏性反应(Hypersensitive induced reaction,HIR)基因TaHIR4,分析其编码蛋白的结构、进化与功能。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦中,分离过敏性诱导基因TaHIR4,并对其进行克隆和序列分析;利用InterProScan、TMpred、SignalP 3.0、PSORT等在线分析工具,预测TaHIR4蛋白的保守结构域、跨膜结构、信号肽、细胞定位等特征;采用DNASTAR软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。【结果】分离到小麦过敏性诱导基因,命名为TaHIR4(867bp,GenBank注册号为FJ028663),该基因编码1条由288个氨基酸组成的多肽;TaHIR4蛋白含HIR蛋白家族的保守SPFH(Stomatins,Prohibitin,Flotillins,HflK/C)、PHB(Prohibitin homologues)结构域,有4种典型的motifs(蛋白激酶、酪蛋白激酶Ⅱ、酪氨酸激酶磷酸化和N-豆蔻酰化位点),N末端的19个氨基酸序列内部存在跨膜信号肽结构,可能属于分泌蛋白;TaHIR4与HvHIR4蛋白的亲缘关系最近,同源性最高(98%),其次为OsHIR4,同源性为91%。【结论】分离到1个条锈菌诱导的小麦HIR基因TaHIR4,其编码蛋白可能属于分泌蛋白,在胞外行使功能。     

小麦蒜氨酸酶基因TaAly1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。     

中国野葡萄锌指蛋白基因的克隆及生物信息学分析

【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。     

烟草品种Xanthi NN碱性β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与生物信息学分析

烟草碱性β－1,3－葡聚糖酶具有较强的抗真菌病害等作用。本研究根据烟草Samsun与抗真菌作用有关的碱性8—1,3－葡聚糖酶基因序列设计引物,以烟草（Nicotiana tabacum）品种Xanthi NN基因组DNA为模板,进行PCR扩增,后将扩增产物与pUC57－T载体重组,再以该重组体转化大肠杆菌DHSα,在对阳性克隆进行鉴定后测序,并对其编码酶蛋白进行了一级、二级、三级结构及蛋白质同源性比较等生物信息学分析。研究结果表明,该基因全长1868bp,包含2个外显子和1个内含子;除终止密码子外,共编码359个氨基酸（GenBank登录号：EU867448）。该酶分子量为28．4kDa,pI为9．72,是一个碱性蛋白;具有多个螺旋、转角、延伸链和无规卷曲等二级结构,其中α－螺旋占35．65％,β－转角占5．57％,延伸链占19．22％,无规卷曲占39．55％;三级结构同源建模预测显示,它与香蕉（Musa supientum）β－1,3－葡聚糖酶（PDB number 2cygA）具有60％的一致性;推测该酶蛋白与颠茄（Atropa belladonna）、马铃薯（Solanum tuberosum）等茄科植物的β－1,3－葡聚糖酶编码序列同源性分别达到89％和81％。本研究结果为进一步开展烟草抗真菌的β—1,3－葡聚糖酶的基因工程研究奠定了重要基础。     

小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1,扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。