香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性,在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系中获得NPR1E基因,命名为MaNPR1E(GenBank登录号分别为：KF582550)。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA,包含一个1 755 bp的最大开放阅读框,编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域,属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明,MaNPR1E与海枣PdNPR3(XP_008808341.1)和油棕EgNPR3(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明,接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制,而在抗病品种中被激活;MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明,MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。     

野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

香蕉NPR1基因的克隆及植物表达载体构建

病程相关基因非表达子(NPR1)是植物抗病信号传导的关键基因。以香蕉抗病香蕉品种为材料,根据NPR1基因序列在保守区设计引物,从香蕉cDNA中克隆获得NPR1基因片段,以RACE的方法克隆获得香蕉NPR1基因的全长,并命名为GCT119-NPR1。香蕉GCT119-NPR1基因最大阅读框(ORF)为1 707 bp。生物信息学分析结果表明,该基因含有ANK和BTB两个结构域,其中ANK结构域是NPR1基因中非常重要的结构域,在蛋白质相互作用中起着至关重要的作用。同源性分析表明,该基因与已克隆发表的NPR1基因氨基酸序列同源性为67%~82%。将其构建植物表达载体,为下一步转化工作奠定基础。     

香蕉中 8 个 WRKY 转录因子的克隆及表达分析

WRKY 转录因子在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解香蕉 WRKY 转录因子的功能,本研究 在香蕉根系中克隆了 8 个 WRKY 家族基因,与香蕉基因组数据库比对后,将其分别命名为 MaWRKY2、MaWRKY21、 MaWRKY44、MaWRKY47、MaWRKY125、MaWRKY136、MaWRKY139 和 MaWRKY147。序列分析和遗传进化树结果表 明,MaWRKY2 和 MaWRKY47 属于第 I 类家族,其余 6 个属于第 II 类家族。对 8 个基因在香蕉的根、球茎、假茎、 叶、花和果中的表达进行分析,结果表明,这 8 个基因在所有的器官中均表达,说明这些基因在香蕉的生长发育过程 中起作用。对 8 个基因在盐、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸、ABA、乙烯和香蕉尖孢镰刀菌生理 4 号小种胁迫处理的 香蕉苗根系中的表达进行分析,结果表明 8 个基因对这些胁迫均有响应,说明香蕉中的这 8 个 WRKY 基因参与了生物 胁迫、非生物胁迫和激素信号途径。     

香蕉中2条MaMLO基因的克隆及表达分析

MLO基因是一类植物特有的抗病基因,为了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了香蕉2条MLO基因,分别命名为MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明,MaMLO1的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸;MaMLO2的开放阅读框为1 689 bp,编码562个氨基酸。系统进化树分析表明,MaMLO1与已登录的香蕉MLO1(XP_009413424)亲缘关系较近,MaMLO2与已登录的香蕉MLO6(XP_009411538)亲缘关系较近。组织特异性研究表明,这2个基因在香蕉各器官中均有表达,但MaMLO2在根中的表达量最大。不同激素处理下的研究表明,MaMLO1受ABA、乙烯和水杨酸诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达;MaMLO2受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达。在感病品种中2个基因均是下调表达,在抗病品种中均是上调表达。结果表明,克隆到的2条MLO在感病品种中没有参与到香蕉抗枯萎病的过程,而在抗病品种中参与了香蕉抗枯萎病的过程。     

茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法

探讨茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件,分析不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位APX活性的变化.结果表明:聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1.5倍,酶提取液pH为7.8.反应液pH为7.O,抗坏血酸(AsA)浓度为0.50 mmol/L时茶树鲜叶APX活性最高;茶树鲜叶APX活性随冷藏时间的延长呈下降趋势;福建7个主要茶树品种以福鼎大白茶的APX活性最高,铁观音的APX活性最低;茶树鲜叶不同叶位APX活性变化趋势为:芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎.     

香蕉泛素结合酶基因的克隆及其功能初步分析

根据香蕉根系均一化全长cDNA文库筛选出一个香蕉泛素结合酶基因的片段通过RACE技术克隆该基因,命名为mauce2.生物信息学分析表明,该基因全长为929 bp,有一个完整的ORF编码148个氨基酸,蛋白分子量为16 505.1 ku,理论等电点为8.41,是一个碱性氨基酸.与江南卷柏、大豆、苹果、拟南芥的同源性为97.97％、97.30％、96.62％、95.95％.器官特异性表达分析表明,该基因在各器官中均有表达,在花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低.     

香蕉MaTET基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆香蕉果实采后成熟相关基因MaTET的全长cDNA,利用生物信息学方法分析MaTET基因及推导蛋白的序列,再利用RT-PCR技术对该基因的组织器官表达特性和在果实采后成熟过程中的表达特性进行分析。结果表明,MaTET的cDNA序列全长为1 234 bp,包含一个852 bp的完整开放阅读框,编码283个氨基酸残基,5′端非编码区222 bp,3′端非编码区160 bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG。MaTET蛋白具4个跨膜区域,属于四跨膜蛋白（Tetraspanins）,拥有多个与信号传导有关的修饰位点,在系统发生上更接近鹰嘴豆、野草莓和番茄等双子叶植物。MaTET可在香蕉根、茎、叶、花以及果实中表达,在根和叶中的表达量高于其它器官;MaTET在自然成熟香蕉果实中的微黄(TY)阶段开始上调表达,在黄多于绿(MY)阶段表达量急遽升高,随后降低,乙烯可增强MaTET表达且表达高峰提前至绿多于黄(MG)阶段,1-MCP抑制MaTET的表达。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

香蕉GAPDH基因家族的生物信息学及转录表达分析

从香蕉基因组数据库和NCBI数据库中检索香蕉GAPDH基因家族的所有成员,并采用生物信息学方法对其进行亚细胞定位、进化树分析和保守结构域预测。克隆测序发现,巴西蕉内的GAPDH基因家族成员序列与小果野蕉基因组数据库中提供的序列基本一致,同源性超过98%。转录表达分析表明,GAPDH基因家族成员在巴西蕉不同器官的表达模式多样:MaGAPCP1,MaGAPC6/8/10/11成组成型表达,其余的基因则在各组织器官间成差异型表达,且差异型表达的基因在不同组织器官中表达模式也不相同,组成型表达的基因在不同组织器官中表达模式虽相同,但表达量有差异。GAPDH基因家族成员在表达模式上的多样化,可能暗示其功能的多样化,这种多样化可能是在进化过程中为适应环境而出现的功能分化或冗余。结果为进一步研究GAPDH基因家族成员在香蕉生长、发育,非生物胁迫,果实后熟等重要生物学过程中的功能奠定基础。     

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸（Vc）是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP cDNA全长序列,共计1510βbp,其中包含1β086βbp的开放阅读框（ORF）,编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599βkDa。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。     

香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR的方法首次在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。经序列测定和Blastx比对分析表明，该cDNA全长1 885bp，编码513个氨基酸残基，具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域，并与其他植物来源的乙醛酸循环体的柠檬酸合酶具有很高的序列相似性，将其命名为MaGCS(Musa glyoxysomal citrate synthase)，并对其进行生物信息学分析，初步预测其理化性质及功能等。     

香蕉苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL）是催化苯丙烷代谢途径第1步反应的限速酶,广泛地参与植物生长发育过程中的各种生理活动。本研究通过生物信息学分析,从香蕉A基因组数据库中利用BLASTp筛选出53个可能的MaPAL编码蛋白序列。在NCBI分析蛋白保守结构域,发现仅有8个基因具有典型的PAL家族基因的特性。聚类分析结果表明香蕉MaPAL家族的8个基因可以分为Class I 和Class II两类。转录组数据表明,所有MaPAL基因在果实发育阶段高表达,MaPAL5参与果实采后成熟过程。在干旱、低温、盐处理的香蕉幼苗叶片中,MaPAL1、MaPAL2、MaPAL3、MaPAL4和MaPAL5成员均显著上调表达,MaPAL6号成员显著下调表达,这些成员参与香蕉响应上述非生物胁迫过程。8个MaPAL成员在枯萎病菌处理下均显著下调表达,表明在感病品种巴西蕉根系中,MaPAL基因的表达全部被Foc TR4抑制。本研究结果为分析MaPAL基因家族在香蕉果实品质形成和响应逆境中的作用提供了理论依据。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

香蕉3个Tau类谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及序列分析

了获得香蕉抗逆相关基因, 通过随机克隆测序和RACE（rapid-amplification of cDNA ends）的方法从香蕉根系cDNA文库中获得3个谷胱甘肽硫转移酶基因, 命名为MaGSTU1、 MaGSTU2和MaGSTU3（GenBank登录号分别为： KC261934、 KC261935和KC261936）。经5′RACE获得3个GST基因全长,分别包含1个627、 675 和699 bp的最大开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）, 分别编码208、 224和232     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

茶树体胚APX基因克隆及其在体胚发生过程中的表达与酶活性分析

以铁观音茶树体胚为材料,克隆了茶树抗坏血酸过氧化物酶基因CsAPX(Genbank登录号为MG799534.1)。CsAPX基因包含一个长度为753 bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸,并对其进行相关生物信息学分析。APX酶活性测定结果表明在球形胚至子叶胚阶段APX酶活性呈现下降趋势,并在子叶胚阶段到达最低值,随着体胚进一步的分化,在子叶胚、成熟胚和萌发胚阶段,茶树APX酶活性不断上升,总体呈"先降后升"的趋势。在体胚发生过程中CsAPX基因的表达分析显示,CsAPX基因在茶树体胚发生的5个阶段均存在显著差异表达,总体呈"升—降—升"的趋势,其中在萌发胚阶段的CsAPX基因的表达水平显著高于其他4个阶段,推测CsAPX基因在体胚发生过程中的萌发胚阶段发挥着重要的作用。     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。