旋毛虫新生幼虫p46 000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T314全长cDNA的克隆及表达

利用PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长T314cDNA的信号肽祛作后重组到原核表达载体pET-28a。将重组质粒pET28-T314转入克隆菌DH5a和表达菌DE3，分别提取质粒进行酶切，测序鉴定。用KIPTG诱导培养重组表达菌DE3，做菌体裂解物外源表达产物的SDS－PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清，采用Western blot检测T314cDNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示：外源T314cDNA的PCR产物在重组质粒pET28-T314中阅读框架正确；SDS－PAGE分析结果显示：经IPTG诱导后转化菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了1条相对分子质量约为39000的新条带，大小与外源cDNA融合蛋白的理论推导值38800相符；Western blot检测结果显示：T314cDNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫，不存在于成虫与肌幼虫，且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。     

旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选，对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明，WN1 cDNA全长为474bp，含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由117个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为13200，等电点为4．25，N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示，此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a，重组质粒经鉴定后，转化大肠杆菌BL21 star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白，与理论设计完全相符。     

Molecular cloning of a cDNA encoding a putative cuticle collagen of Trichinella spiralis

A 5-day-old adult stage-specific cDNA fragment from Trichinella spiralis was identified by suppression subtractive hybridization and was used as a probe to screen the cDNA library. The cDNA sequence coding for a putative T. spiralis cuticle collagen was isolated. The cDNA encoded an open reading frame of 343 amino acid residues with molecular weight of 35.1 k Da. The deduced protein contained an N-terminal signal peptide, a nematode cuticle collagen N-terminal domain and a collagen triple helix repeat domain. Searches in GenBank using BLASTP showed up to 47% identity to cuticle collagens from other nematodes. Southern blot analysis of genomic DNA indicated this gene was present as a single copy in T. spiralis genome.     

Molecular cloning and expression of a larval immunogenic protein from the cattle tick Boophilus annulatus

A full-length cDNA of an immunogenic protein was cloned from a cDNA library of the local Egyptian cattle tick Boophilus annulatus. Antibodies raised against B. annulatus larval proteins were used to screen a cDNA expression library. A 936bp cloned fragment was sequenced and showed an open reading frame of 516bp encoding a protein of 171 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequence with protein data bank revealed that the sequence is related to a sequence isolated from the hard tick Haemaphysalis qinghaiensis (Hq05). Southern blot analysis of B. annulatus genomic DNA showed that the cloned cDNA hybridized to double bands per restriction digest, suggesting that the cloned cDNA is a double copy gene. Amino acid analysis of the cloned gene revealed the presence of two casein kinase II phosphorylation sites in the N-terminal domain suggesting that this molecule may be involved in the signal transduction or gene expression pathways. RT-PCR and northern blotting revealed the presence of two isoforms of the Ba05 gene in salivary glands and in the 3-day-old eggs. The cloned gene without the signal peptide, was expressed in Escherichia coli under T7 promotor of pET-30b vector, and purified under denaturation conditions. The purified protein appeared as a single band on 12% SDS-PAGE with a molecular weight around 22.8kDa including the histidine tag of the vector. Antibodies raised against the purified molecule were used to detect the B. annulatus homologue to the Hq05 gene in whole tick, larvae and gut protein extracts. Immunoblotting revealed the presence of this molecule Ba05 only in whole tick and larval protein extracts and not in the gut protein extract. Using the same antibodies, homologues to the Ba05 gene were detected in other tick species as Hyalomma dromedarii and Rhipicephalus sp. but not in Ornithodoros moubata.     

家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究

从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。     

旋毛虫肌幼虫p53cDNA的克隆及鉴定

根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

家蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因BmSPI3的克隆与表达特征分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)在机体的发育、免疫等生理过程中发挥重要的作用。从家蚕蛹cDNA文库中获得一条全长为728bp的基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现其蛋白具有保守的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(CⅠ-X3-CⅡ-X8-CⅢ-X14-CⅣ-X6-CⅤ-X13-CⅥ),且P1活性位点为赖氨酸(K),因此将该基因命名为BmSPI3(Gen-Bank登录号:DN237641)。通过PCR扩增BmSPI3基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-BmSPI3,并转化到E.coliBL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳检测在约36kD处有明显的蛋白表达条带。提取各发育时期蚕体和5龄幼虫各个组织的总RNA进行荧光定量PCR,检测结果表明:BmSPI3在5龄幼虫期表达量最高,卵期最低;在5龄幼虫表皮中的表达量最高,在马氏管的表达量最低。推测BmSPI3对胰蛋白酶和类胰蛋白酶具有抑制作用。     

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。     

鲤鱼肿瘤坏死因子受体相关因子6全长cDNA克隆及序列分析

本试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)EST序列为基础,经地高辛标记后作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从重组噬菌体中经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含有5'-非编码区(5'-UTR) 25 bp;3'-非编码区(3'-UTR) 535 bp,存在2个mRNA不稳定基序ATTTA;开放阅读框ORF长1632 bp,编码543个氨基酸。预测蛋白质等电点为5.88,分子质量大小为61.773 ku。序列同源性比对结果表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼TRAF6a基因同源性达99%。蛋白质序列分析结果发现,其具有TRAF家族的典型序列特征。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

犬弓首蛔虫雄虫cDNA文库构建及EST分析

为构建T.canis雄虫cDNA文库,采用Trizol法提取T.canis雄虫的总RNA,合成cDNA,连接到λTripEx2载体上,通过包装蛋白对连接产物的包装,接种到大肠杆菌XL-1-Blue中进行原始文库和扩增文库的滴度测定.经质量鉴定表明:初始文库的滴度为5.25×106 pfu·mL-1,扩增后文库的滴度为6.90×109 pfu ·mL-1.文库的插入片段大小在500～2 000 bp,平均片段大小为1 000 bp,重组率为99.47％.所有指标均显示已成功构建了T.canis雄虫的cDNA文库.利用该文库获得了189条5'有效表达序列标签(EST).对ESTs拼接后代表了101个Unigenes,含有27个Contigs和74个Singletons.其Unigenes在GenBank中的序列号为HO348195～HO348295.同源性分析检索到有56个Unigenes与已知基因同源,其中具有已知或推测功能的基因有40个,未知功能基因有16个,未比对上的基因45个.未比对上的基因与NR数据库中的蛋白序列没有任何意义的匹配,为研究中发现的新基因.这些结果为进一步开展犬弓首蛔虫功能基因及分子机制研究奠定了基础.     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

Construction and Characterization of the Yeast Two-hybrid cDNA Library of ST Cells

To seek out proteins interact with VP2 structural protein of porcine parvovirus (PPV) in ST cell and study the molecular mechanisms of viral infection and pathogenicity, a ST cDNA yeast hybrid library was created. Firtly,the total RNA of ST was extracted using RNeasy Min Kit,and double strands cDNA was synthesized by SMART technique. Then, the ST cDNA library was successfully created by homologous recombination in yeast, the titer was 8.1×10⁸ CFU/mL, the inserts varied from 250 to 1 000 bp,the average of inserted fragments was about 500 bp,and the recombination rate was 96%.These datas indicated that the yeast two-hybrid cDNA library was successfully constructed and might be useful for screening the host proteins interacting with structure protein of PPV.