猪伪狂犬病病毒河北变异株的分离鉴定及其gE基因序列分析

河北省某猪场猪群已免疫伪狂犬病(pseudorabies,PR)gE基因缺失苗,但仍发生了伪狂犬病疫情。本研究经PCR检测、组织病理学观察、免疫组化染色、病毒分离鉴定、动物试验等,从疑似PR病料中分离鉴定了1株伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),并对该病毒进行gE基因序列分析。结果表明,分离毒gE基因的开放阅读框由1 740 bp组成,编码580个氨基酸。该病毒gE基因与23株PRV参考毒株之间具有较高的同源性,核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.5%～99.9%和95.3%～99.7%,与HLJMDJ2013、HeBLP2014、AHSZ-16株核苷酸同源性最高,均为99.9%。与2012年以来分离的变异株(Fa株除外)的gE基因存在相同的独特分子变异特征。遗传进化分析表明,该病毒与其他亚洲毒株同属第1群。动物试验表明该株病毒对兔具有很强的致病性,攻毒组兔全部发生死亡,并能引起兔出现典型的伪狂犬病神经症状。本研究为河北省生猪健康养殖与疾病防疫提供了数据基础和警示预警。     

广西陆川某猪场猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及gE基因的分析

为了确诊猪伪狂犬病病毒(PRV)的感染,探讨目前广西猪群中流行的PRVgE基因的变异特征,为更好地防控猪伪狂犬病(PR)提供参考依据,本研究采集了广西陆川某猪场保育猪群发生呼吸道症状的肺脏组织,并用Vero细胞进行病毒分离,应用PCR方法对分离株的gE基因进行克隆和测序,根据测序结果证实分离到1个PRV毒株,命名为GXLC1。分离株在Vero细胞上增殖,细胞出现典型的病变;GXLC1株gE基因与GenBank上20株国内外具有代表性参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%,氨基酸同源性为94.3%~99.6%;gE基因的遗传进化分析显示,GXLC1株与2012年的国内流行毒株亲缘关系较近,与欧美分离株亲缘关系较远;氨基酸序列分析显示,GXLC1株gE蛋白主要抗原表位区较之国内经典强毒株有3个氨基酸位点的变异,可能导致gE抗原性发生改变。本研究将分离到的1个PRV毒株进行了gE基因的分析,发现GXLC1株为近年来流行的变异株,gE蛋白在抗原表位区上有3个氨基酸位点的变异,这是否会影响GXLC1株毒力和抗原性的变化,还有待进一步研究;对gE基因变异特征的分析和病毒的分离为进一步丰富广西PRV的分子流行病学和疫苗的研制提供参考依据和重要材料。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

2012-2013年新流行猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE、TK、gD基因序列分析

2012年伊始,猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)在河南省部分地区再次暴发。为探寻其中缘由,对2012年3月至2013年6月间采集的疑似PR病料接种Vero细胞并经PCR鉴定,分离到4株伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)。同时对该4株病毒的gE、TK和gD基因进行PCR扩增、克隆、测序及分析。序列分析显示:4株PRV河南分离株的gE、TK、gD基因有些核苷酸及氨基酸发生变化,不同于参考毒株;遗传进化分析显示:4株PRV河南分离株形成单独1个小亚群,与中国其他地区分离株之间的亲缘关系较近,与欧洲、南美洲分离株之间的亲缘关系较远,推测此4株河南分离毒株是新型国内流行株。     

伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析

从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株,对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定,并与GenBank上发表的国内外毒株进行序列分析和遗传进化分析.结果 显示,病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变.该毒株gG基因核苷酸序列与国内分离毒株的同源性为99.7％～100.0％,与国外分离毒...     

猪伪狂犬病病毒粤A株gE基因的克隆与鉴定

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株进行了PCR扩增,PCR产物克隆到pMD18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实已克隆到PRV粤A株的gE全基因。     

猪伪狂犬病病毒GXBB株的分离鉴定及gE基因的克隆分析

从广西玉林博白某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价（TCID₅₀）为10^-7.22/0.1 ml。设计扩增PRV gE胞外区基因的引物,能扩增出约947 bp的特异性片段,将扩增出的目的片段进行克隆、测序,并与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.7%～99.4%之间,氨基酸同源性在98.1%～99.1%之间,上述结果证实该分离毒株为伪狂犬病病毒,命名为GXBB株。GXBB株与国内流行毒株同源性很高,说明目前广西PRV流行株变异不大。这为下一步广西伪狂犬病的预防和净化工作提供科学的理论基础。     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

猪伪狂犬病病毒FZ-2012株的分离鉴定及其gE基因的遗传演化分析

从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

伪狂犬病病毒云南变异毒株的分离鉴定及gE、gD、gC、TK基因序列分析

2013-2016年期间,从云南陆良、富源、寻甸及西双版纳规模猪场经Bartha-K61疫苗免疫猪群中发生流产的胎儿内脏组织病料中成功分离获得4株伪狂犬病病毒流行毒株,分别命名为FY-YN-2014、LL-YN-2014、XSBN-YN-2015和XD-YN-2014株。经TCID_(50)测定、动物致病性试验、免疫保护试验及gE、gD、gC、TK基因序列分析,结果显示TCID_(50)分别为10~(-6.083)/100μL、10~(-5.75)/100μL、10~(-6.583)/100μL、10~(-6.5)/100μL。采用Bartha-K61疫苗免疫过的经产母猪血清样品对XSBN-YN-2015分离毒株进行微量病毒中和试验,其结果显示gB抗体阳性、gE抗体阴性的血清样品的中和效价在1∶16～1∶32之间,用gB、gE抗体均为阳性的血清样品时,其中和效价在1∶64～1∶128之间。4株分离毒株接种昆明小白鼠、家兔2～5 d后,均出现奇痒的典型伪狂犬病临床症状。对健康非免疫断奶仔猪进行攻毒,同样出现伪狂犬病的典型发病症状,且能从脑及内脏组织中扩增出伪狂犬病病毒gE基因并成功回收分离到病毒株。在昆明小白鼠上的LD_(50)分别是10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.875) TCID_(50)、10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.5) TCID_(50)。XSBN-YN-2015株在非免疫断奶仔猪(伪狂犬病病毒gE、gB抗体阴性)测得的LD_(50)=10~(5.33) TCID_(50)。XSBN分离毒株对免疫2次Bartha-K61疫苗的断奶仔猪的攻击试验结果显示,被攻击仔猪均出现高热、精神萎顿、厌食等临床表现,但1周后均能耐过并逐渐康复,提示Bartha-K61疫苗株免疫猪只对当前流行的伪狂犬病病毒云南变异毒株的攻击基本能够提供100%保护。4株伪狂犬病病毒云南流行毒株与近年来国内报道的TJ、HeN1、NH1201等变异毒株的gE、gC、gD及TK基因核苷酸及氨基酸序列均高度一致,同源性高达99%～100%,均分属于同一进化树分支,不过与早期的国内毒株SC、GDSH株,国外毒株Becker、Nia-1、CL15、Kaplan、Kolchis、Hercules、NIA3及疫苗株Bartha相比,均存在一定程度的变异,也未分属于同一进化分支,因此,4株伪狂犬病病毒云南流行毒株也属于变异毒株。     

猪伪狂犬病病毒gE基因的研究进展

猪伪狂犬病是猪的重要疾病之一。近年来 ,随着分子生物学研究的深入 ,对伪狂犬病病毒的研究也取得了显著的进展。本文着重对毒力基因gE基因的特性 ,基因的结构特点 ,在基因工程疫苗中的重要性以及在根除计划中的作用做了较详细的综述     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离鉴定及其gE基因遗传变异分析

自2011年下半年以来全国多个省份使用Bartha-K61疫苗(gE/gI双缺失)免疫的猪场陆续出现了母猪繁殖障碍、仔猪神经症状及死亡、伪狂犬gE抗体阴性猪群突然转阳的问题。同时有的猪场内出现犬、猫、鼠等死亡的现象,经检测都是由变异伪狂犬病病毒(vPRV)引起。为了解山东省猪伪狂犬病病毒(PRV)近期流行特征,本试验对2017年上半年来自山东省不同地区的12份伪狂犬疑似病料进行了PRV的分离鉴定,并对分离株的gE基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果表明,共分离到9株PRV,其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.5%～99.4%和97.2%～99.1%,与参考毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.5%～99.8%和96.8%～99.2%,并且9株分离株与国内报道的PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。gE基因的遗传进化树分析表明,本试验中9株分离株相互之间遗传距离较近,与国内PRV变异株处在同一分支,而与欧美毒株遗传距离较远。     

猪伪狂犬病病毒野毒株的分离鉴定及gC、gD基因序列分析

2019年河南某猪场暴发疑似猪伪狂犬病疫情,本试验采集发病猪的病料组织,进行伪狂犬病病毒(PRV)毒株的分离鉴定,并分析分离毒株的生物学特性。结果显示：分离毒株HNCY的TCID₅₀为10^-8.48/0.1 mL;一步生长曲线显示,分离毒株在12～24 h复制较快,48 h到达最高峰;分离毒株对小鼠具有较强的致死性,且肺脏中病毒含量最高;序列分析显示,HNCY株gC基因核苷酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为95.9%～100.0%,gD基因同源性为98.9%～100.0%;gC氨基酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为92.9%～100.0%,gD氨基酸同源性为97.5%～100.0%,且国内同源性高于国外;遗传进化分析显示,HNCY分离株gC、gD基因与欧美毒株在不同的大分支上,亲缘关系远;与国内分离株在同一分支上,且与2011年之前分离的PRV毒株在不同的小分支上,表明HNCY分离株属于国内变异毒株。     

猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析

根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.