松材线虫和拟松材线虫不同株系线粒体DNA RAPD分析

对松材线虫7个株系和拟松材线虫2个株系的线粒体DNA随机扩增多态性分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的变异性,但种间变异明显大于种内变异,因而支持将松材线虫和拟松材线虫划分为两个不同的种.两个拟松材线虫株系(法国株系和日本株系)之间的相似值和松材线虫各株系间的相似值极为接近,由此看来,这两个株系的变异为种内变异,应同属于一个种.聚类分析的结果表明,松材线虫和拟松材线虫系两个明显不同的类群,即松材线虫类群和拟松材线虫类群.松材线虫类群又分为两个亚组,一个是以日本株系为代表,另一个是以北美洲(美国和加拿大)株系为代表.     

松材线虫实时PCR检测方法的建立

对南京林业大学开发的松材线虫实时PCR检测方法的操作过程进行了规范化.介绍了检测松材线虫所需要的试剂及使用方法,对仪器的稳定性进行了验证,对检测结果的判读方法进行了规定.规范化的检测方法灵敏度高,特异性强,应用方便.     

松材中两种重要线虫比较的研究

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和拟松材线虫(B.mucronatus)被进一步证明是两个不同的种。除表现致病力差异外,形态上具有明显的不同特征,特别是前者交合伞卵圆形,后者平截形;生理学试验表明二者不能交配产生后代;生物化学方面的差异是:酯酶凝胶电泳中松材线虫酯酶带3条,迁移率分别为0.42、0.45、0.49;而拟松材线虫只1条酯酶带,迁移率为0.65。二者脂肪酸总量、不饱和度、短链和长链脂肪酸含量都有明显的差异。     

松材线虫和拟松材线虫繁殖能力差异研究

松材线虫作为外来入侵种,逐步取代拟松材线虫占据生态位。初步研究表明这可能与两种线虫的繁殖能力差异关系密切。本研究采取了两种方法,即离体条件竞争试验和体内竞争试验比较二者繁殖力。结果表明,松材线虫的繁殖水平明显高于拟松材线虫。松材线虫和拟松材线虫混合物长时间培养后,松材线虫逐步竞争淘汰拟松材线虫。除此以外,离体培养和体内竞争结果均表明,竞争条件下松材线虫的繁殖力高于非竞争条件。     

松材线虫与拟松材线虫的几种鉴别方法

在形态、生化与分子以及致病性3个方面综述了松材线虫和拟松材线虫的鉴别方法,旨在为松材线虫病的防治和进出口检疫提供更多更安全的检疫方法,同时为更好的区别两种线虫提供理论依据。     

松材线虫和拟松材线虫不同株系致病性的研究*

１９９０－１９９３年，从国内外收集的松材线虫９个株系和拟松材线虫５个株系，用皮接法接种３－６年生的松苗，测定线虫的致病性。结果表明，松材线虫的致病力明显高于拟松材线虫，其中国内的５个株系致病力最高，拟松林线虫通常不致病或致病力极低，在同一线虫种内，株系间致病力随寄主不同而不同。在寄主死亡速度上，寄主相同并死亡率相同或相近时，采自南京、广东马尾松病树上的线虫株系接种后，寄主平均死亡时间略短于其它株系     

松材线虫分子生物学检测技术研究进展

概述松材线虫分子生物学检测技术的基础，介绍了DNA探针技术、基于PCR的检测技术和卫星DNA技术等分子生物学检测方法，并对PCR-RAPD、PCR-RFLP和PCR-SSCP技术进行了比较。     

松材线虫提取液和分泌液中纤维素酶定性检测

纤维素酶Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ已被证实在松材线虫Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ（ＳｔｅｉｎｅｒｅｔＢｕｈｒｅｒ）Ｎｉｃｋｌｅ致病过程中起重要作用。通过多种方法对这一特异性物质进行生化检测，从中筛选出一种简单灵敏的检测方法——纤维素酶扩散法。该方法以羧甲基纤维素钠为酶底物，超薄层琼脂板为反应板，刚果红为染色剂，乙酸为中止反应剂。用这种方法分别以松材线虫虫体提取液和分泌液进行纤维素酶的定性检测，结果均呈阳性反应，说明松材线虫虫体含纤维素酶，且向体外分泌。这对区分松材线虫和拟松材线虫Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ（ＭａｍｕｙａｅｔＥｎｄａ．）两个相似种及松材线虫病的诊断和检疫都有重要意义。     

松材线虫和拟松材线虫雄虫交合伞形状的比较

松材线虫和拟松材线虫雄虫交合伞形状的比较刘伟，杨宝君关键词松材线虫，拟松材线虫，雄虫交合伞松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。病原松材线虫ＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓＮｉｃｋｌｅ（简作Ｂｘ）的形态与非病原拟松材线虫Ｂ．ｍｕｃｒｏｎ...     

疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径     

松材线虫近交系的培育

松材线虫种群间及种群内存在高度的遗传多样性.为了增加其基因的纯合性,以强毒松材线虫虫株AMA3为原始种群,采用连续全同胞兄妹交配培养20代的方式进行近交系培育,共获得来自3对不同亲本的80个近交系.以感病黑松为宿主比较AMA3原始种群及不同近交种群的致病力.结果表明,连续近交未对松材线虫的致病力造成显著影响,来自3对亲本的F6,F10,F15及F20松材线虫种群依然保持强致病力.     

松材线虫rDNA-ITS2的TaqMan探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 ,DNA测序结果与实时荧光PCR结果一致     

流胶法在长岛县防治松材线虫病中的应用

长岛县是我国北方松材线虫病的唯一疫区。 1999年用流胶法对长岛疫区内约 4 0 0多hm2 的松林内的感染松材线虫黑松病树进行早期诊断 ,结果表明低温对流胶法影响很大。在约 6 0 0 0 0 0株松树中 ,发现 935株松树流胶异常 ,从这些松树中取样经分离镜检发现 182株松树带有松材线虫 ,伐除这 182株松材线虫病树后 ,当年松材线虫病树死亡率减少 97%。对流胶法在生产上的应用进行了讨论。     

松墨天牛携带的松材线虫PCR检测技术

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5'-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3',下游引物:5'-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3'),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403 bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段.该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来.在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出松材线虫的技术,并在实际运用中得到检验.     

松材线虫乙酰胆碱酯酶1基因沉默及蛋白抑制剂

[目的]为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(BxACE1)进行研究.[方法]松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫.克隆BxACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果.[结果]5′和3′序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为BxACE1.同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致.蛋白质三维结构分析表明,BxACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking技术筛选出石杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶1蛋白的较佳抑制剂.RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果,石杉碱甲本身对线虫毒性较小,共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小,但RNAi处理组线虫与Inhibitor(0.03％苦参碱+1μmol· L-1石杉碱甲处理线虫)处理组线虫在24,48及72h存活率差异不显著,表明石杉碱甲处理线虫和BxA CE1基因RNAi处理效果相近.[结论与其他]通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断BxACE1功能均可以提高苦参碱的杀虫效果,RNAi技术能够简单易行地证明若阻断BxACE1功能可以提苦参碱的杀虫效果,但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用.石杉碱甲可以与BxACE1稳定结合,鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果,具有生防药剂辅剂的开发潜力,可替代基因沉默技术实现抑制BxACE1的目的.因此,通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断BxACE1的功能,进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的.ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性,使线虫体内的胆碱水平短时间内大量提高,从而导致其中毒死亡.该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物,大多为非可逆型ACEIs.石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱,是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs.本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究,是对该植物源药剂的一个新尝试.     

克线磷防治松材线虫病的研究

为防治松材线虫病，１９８８－１９９２年间，使用３种药剂对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）进行室内毒性测定，并选用５％克线磷颗粒剂在林间、盆栽树苗上作防治试验．巴丹在１００×１０－６时，线虫仍可存活、繁殖；Ｆ—００１药剂在５０×１０－６以上时，灭虫率均可达９０％以上，克线磷浓度在６０×１０－６以上时，则可完全抑制线虫的生长繁殖．在林间，以克线磷处理的黑松（Ｐｉｎｕｓｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）植株，均比对照株死亡率低．盆栽苗上的施药、接种试验，更进一步证实了该药剂的防病效果．     

松材线虫病疫木热烘处理杀虫试验

将松材线虫病疫木分成(100mm×100mm×50mm、90mm×70mm×500mm、90mm×18mm×500mm) 3个测试处理,每处理设4个重复,加温至85℃后开始计时,分别持续3 h和5 h,并设相应对照。按常规分离程序进行分离和镜检,结果表明,经3 h加温热烘的锯板中还有松材线虫活体,而5 h加温热烘能有效杀灭线虫及天牛幼虫,杀虫率达100％。     

舟山松材线虫病的发生及除治

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。本文就松村线虫病在舟山地区的发生、分布及除治等进行了论述。     

福建省马尾松枯死木中线虫检测结果分析

对2001~2005年福建省9个(地)市48个县(市、区)采集来的5 751个马尾松枯死木进行线虫分离镜检,结果表明:松枯死木中含有线虫率平均为91.29%,其中拟松材线虫占67.56%,其它线虫(线虫种类有待进一步鉴定)占23.73%,无线虫的占8.71%。应用木材小棍分离的线虫密度平均为1 028条.g-1,显著高于应用木屑分离的线虫平均密度286条.g-1。在垂直分布上,不同季节拟松材线虫在松枯死木树干中广泛分布,均表现为3种类型:Ⅰ型为树干上部线虫密度大于中、下部;Ⅱ型为树干中部线虫密度大于上、下部;Ⅲ型为树干下部线虫密度大于上、中部。在水平分布上,不受季节的影响,不管是秋季还是春季,均是内材的线虫密度863~1 563条.g-1(平均1 138条.g-1)6、89~1 463条.g-1(平均986条.g-1)高于相应的外材线虫密度342~631条.g-1(平均586条.g-1)、209~431条.g-1(平均325条.g-1)。因此,在对我省各地在松材线虫病监测时,应在树干上、中、下不同部位,并靠近树干中间同时取样,以木材小棍分离线虫较准确。     

松材线虫SCAR标记与检测技术

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’),反向引物为M05R1(5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。